SILAC Based proteomik karakterisering av exosomes från HIV-1-infekterade celler

Många mänskliga sjukdomar, inklusive virusinfektioner, är ofta förknippade med distinkta cellulära processer som äger rum i och runt de drabbade cellerna. Proteiner, ofta i egenskap av den ultimata cellulära effektorer, medla dessa processer. Analys av proteinerna ofta kan ge ovärderlig information om den lokala miljön av påverkade celler och hjälpa oss att förstå den bakomliggande mekanismen för sjukdom patogenes. Bland olika proteinanalystekniker, har proteomik särskilt stort löfte. Som ett kraftfullt, storskaliga verktyg kan proteomik tillhandahålla en systemisk förståelse av cellulära processer, i synnerhet i området av funktionen och interaktionen av proteiner. Analysera specifika proteiner görs enklare genom utveckling av märkningstekniker, som tillåter forskare att övervaka uttrycket av cellulära komponenter, i synnerhet proteiner, i stället för undersökningen. Även om många proteomik analyser har gjorts på cellproteom skala, proteomik karakteriseringar på subcellulära fack har visat sig vara särskilt upplysande ^en. Detta exemplifieras väl i studier av HIV-1-infektion.

Exosomes, 30-100 nm membranvesiklar som utsöndras av ett brett spektrum av celltyper ^{2, 3,} är kritiska komponenter i intercellulär kommunikation och molekylär transport. De tidigare upptäckt att spela viktiga roller i HIV-1 spirande process ^{4, 5.} Genom att kombinera proteomik analys med funktionell dissekering, fann vi att exosomes frigörs från HIV-1-infekterade celler består av en unik och kvantitativt olika protein signatur och hamnen reglerande molekyler som påverkar cellulära egenskaper på angränsande receptiva celler, inklusive cellulär apoptos och proliferation ^6. Metoderna beskrivs i detta protokoll,nämligen SILAC (stabil isotop märkning av aminosyror i cellkultur) ⁷ baserat proteomic karakterisering av exosomer från HIV-1-infekterade celler. Liknande tillvägagångssätt kan användas för att bättre förstå andra subcellulära fack under patogenes genom att justera experimentell spännings till den specifika avdelning eller del av intresse och göra nödvändiga ändringar av de beskrivna förfarandena.

Med tanke på den senaste utvecklingen av kvantitativa proteomik metoder, det finns många att välja mellan när du väljer den mest effektiva metoden för en viss experiment. Bland dessa är den kemiska-baserade iTRAQ (isobariska taggar för relativ och absolut kvantifiering) ⁸ och etiketten fria MRM (multipel övervakning reaktion) ⁹ tekniker. Båda metoderna är kraftfulla verktyg och är bra val för specifika inställningar. För en typisk laboratorie huvudsakligen arbeta med cellinjer, emellertid är dessa två metoder har relatively högre kostnader och är mer tidskrävande i jämförelse med den SILAC baserade metoden. SILAC är en metabolisk baserat märkningsteknik som innehåller icke-radioaktiva isotopiska former av aminosyror från odlingsmedierna i cellulära proteiner. Typiskt SILAC experiment börjar med två cellpopulationer, till exempel, infekterade och oinfekterade. Varje differentiellt märkt i sin specifika isotop miljö tills full märkning uppnås. De märkta exosomer av dessa celler utsätts sedan för proteinextraktion. När utvunnits, de märkta exosomal proteinerna analyseras med hjälp av vätskekromatografi tandem masspektroskopi ^10. Slutligen masspektrometri resultat och kraftigt märkta proteiner utsattes för statistisk och bioinformatik analyser samt strikt biokemisk kontroll. Våra tidigare undersökande rapporter tyder på att SILAC / Exosome förfaranden är mer lämpade för cellinjer än primära celler, som cellinjer är vanligtvis i enaktiv prolifererande tillstånd för effektiv isotopmärkning,