SILAC basada en proteómica Caracterización de exosomas del VIH-1 en células infectadas
Summary
A continuación, describimos un método de proteómica cuantitativa mediante la técnica de etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular (SILAC) para analizar los efectos de la infección por VIH-1 en proteomas exosomal anfitrión. Este protocolo se puede adaptar fácilmente a las células bajo diferentes condiciones de estrés o infección.
Abstract
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Introduction
Muchas enfermedades humanas, incluyendo las infecciones virales, a menudo se asocian con procesos celulares distintivas que tienen lugar en y alrededor de las células afectadas. Proteínas, actuando a menudo como los efectores celulares en última instancia, a mediar en estos procesos. El análisis de las proteínas a menudo puede proporcionar información muy valiosa sobre el medio ambiente local de las células afectadas y nos ayudan a comprender el mecanismo subyacente de la patogénesis de la enfermedad. Entre las diversas técnicas de análisis de proteínas, proteómica es válido especialmente una gran promesa. Como una herramienta de gran alcance, a gran escala, la proteómica pueden proporcionar una comprensión sistémica de procesos celulares, particularmente en el área de la función y la interacción de las proteínas. El análisis de las proteínas específicas se hace más simple mediante el desarrollo de técnicas de etiquetado, que permiten a los investigadores para controlar la expresión de los componentes celulares, particularmente proteínas, en el sitio de investigación. Aunque muchos análisis proteómicos se han realizado en el celularescala proteoma, caracterizaciones proteómicos en compartimentos subcelulares han demostrado ser particularmente informativa 1. Esto se ejemplifica también en los estudios de la infección por VIH-1.
Los exosomas, 30-100 nm vesículas de membrana secretadas por una amplia gama de tipos de células 2, 3, son componentes críticos de la comunicación intercelular y el transporte molecular. Fueron descubiertos previamente a jugar un papel importante en el proceso de gemación del VIH-1 4, 5. Mediante la combinación de análisis proteómico con disección funcional, se encontró que los exosomas liberados de las células infectadas por VIH-1 se componen de una firma de proteínas y moléculas reguladoras puerto únicos y cuantitativamente diferentes que afectan a las propiedades celulares en células receptivas, incluyendo la apoptosis y la proliferación celular 6 vecina. Los métodos se describen en este protocolo,a saber SILAC (etiquetado de isótopos estables de aminoácidos en cultivo celular) 7 basado caracterización proteómico de exosomas de células infectadas por VIH-1. Enfoques similares se pueden aplicar para entender mejor otros compartimentos subcelulares durante la patogénesis mediante el ajuste de la tensión experimental para el compartimento o fracción de interés específico y hacer los cambios necesarios a los procedimientos descritos.
Dado el reciente desarrollo de métodos cuantitativos proteómicos, hay muchos para elegir a la hora de seleccionar el método más eficiente para un experimento particular. Entre ellas se encuentran la iTRAQ basada en productos químicos (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) 8 y el MRM libre de etiquetas (monitorización de reacción múltiple) 9 técnicas. Ambos métodos son herramientas potentes y son buenas opciones para la configuración específica. Para un laboratorio típico de trabajo principalmente con líneas celulares, sin embargo, estos dos métodos tienen relatively mayores costos y son más tiempo en comparación con el método basado SILAC. SILAC es una técnica de etiquetado en base metabólica que incorpora formas isotópicas no radiactivas de aminoácidos de los medios de cultivo en las proteínas celulares. Típicamente, los experimentos SILAC comienzan con dos poblaciones de células, por ejemplo, infectadas y no infectadas. Cada uno está marcado diferencialmente en su entorno isotópica específica hasta que se logre el etiquetado completo. Los exosomas marcados de estas células se someten entonces a la extracción de proteínas. Una vez extraídas, las proteínas exosomal marcadas se analizaron mediante cromatografía líquida espectrometría de masas en tándem 10. Finalmente, los resultados de espectrometría de masas y las proteínas marcadas de manera significativa son sometidos a estadística y análisis de la bioinformática, así como la comprobación bioquímica riguroso. Nuestros informes de investigación anteriores sugieren que los procedimientos de SILAC / exosoma son más apropiados para las líneas de células que las células primarias, ya que las líneas celulares son por lo general en unaestado de proliferación activa para el etiquetado isotópico eficiente,
Protocol
Representative Results
Discussion
En los procedimientos descritos en este documento, hemos demostrado la aplicación de la técnica SILAC para investigar el efecto de la infección por VIH-1 en el proteoma exosomal anfitrión. Inicialmente, las células infectadas no infectados y el VIH-1 son diferencialmente marcado con isótopo. Los exosomas diferencialmente marcadas se purificaron entonces antes de realizar la extracción de proteínas. A continuación, se emplea cromatografía de líquido tándem espectrometría de masas para analizar el proteoma ex…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un suplemento de ARRA a la vida útil / Tufts / Castaño CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, y K24HD080539 a la BR. Este trabajo también fue apoyado por el Fondo de Investigación Piloto Vida útil (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20133969), y los NIH COBRE URI / RIH Investigación Piloto Grant (P20GM104317) a ML. Agradecemos a James Myall y Vy Dang para obtener ayuda con la preparación del manuscrito y la figura.
Materials
| H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
| Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
| MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
| Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
| SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
| L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
| L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
| HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
| Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
| Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
| Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
| 50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
| Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
| RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
| Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
| SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
| Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
| Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
| Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
| Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
| Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
| Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
| Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |
Riferimenti
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
- Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
- Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
- Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
- Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
- Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
- Strober, W. . Current Protocols in Immunology. , (2001).
- Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
- Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
- Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , 22 (2006).
- Olson, B. J. S. C., Markwell, J. . Current Protocols in Protein Science. , (2001).
- Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
- Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
- Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
- Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
- Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
- Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
- Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
- Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, 417-422 (2009).
- Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, 561-568 (2011).
- Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , (2006).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
- Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
- Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).
