Un metodo rapido per la lavorazione del sangue per aumentare la resa dei livelli plasmatici del peptide nel sangue umano
Summary
Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani e produce livelli di peptide superiori e consente la valutazione della forma molecolare corretta. Pertanto, questo metodo sarà uno strumento prezioso nella ricerca del peptide.
Abstract
La ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Questo spesso include la misurazione dei peptidi che regolano l'assunzione di cibo. Per la corretta determinazione della concentrazione di un peptide, dovrebbe essere stabile durante il trattamento del sangue. Tuttavia, questo non è il caso di diversi peptidi che vengono rapidamente degradati da peptidasi endogene. Recentemente, abbiamo sviluppato un metodo di trattamento del sangue che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution (RAPID) per l'utilizzo nei ratti. Qui, abbiamo stabilito questa tecnica per l'uso nell'uomo e indagato recupero, forma molecolare e circolanti concentrazione di cibo ormoni regolatori. Il metodo RAPID ha migliorato significativamente il recupero per 125 I-marcato somatostatina-28 (+ 39%), glucagone-like peptide-1 (+ 35%), acile grelina e glucagone (+ 32%), l'insulina e kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), la leptina(+ 21%) e peptide YY 3-36 (+ 19%) rispetto al trattamento standard (sangue EDTA su ghiaccio, p <0.001). cromatografia liquida ad alte prestazioni ha mostrato l'eluizione di endogena grelina acile nella posizione prevista dopo l'elaborazione RAPID, mentre dopo il trattamento standard di 62% di acil grelina sono stati degradato con conseguente un picco precedente probabile che rappresenta desacyl grelina. Dopo l'elaborazione del rapporto RAPID grelina acil / desacyl nel sangue di soggetti normali di peso è stato di 1: 3 rispetto al 01:23 dopo trattamento standard (p = 0,03). Anche i livelli endogeni Kisspeptin erano più alti dopo RAPID rispetto al trattamento standard (+ 99%, p = 0,02). Il metodo di trattamento del sangue RAPID può essere utilizzato negli esseri umani, produce peptide superiori e permette di valutare la forma molecolare corretta.
Introduction
Alla luce della crescente diffusione in tutto il mondo di obesità 1,2, la ricerca nel campo della regolazione dell'assunzione di cibo sta guadagnando importanza. Mentre finora solo un peptide noto che perifericamente prodotta e azione centrale per stimolare l'assunzione di cibo, cioè grelina 3, negli ultimi decenni, una vasta gamma di peptidi è stato identificato che riducono l'assunzione di cibo, ad es. leptina, peptide YY (PYY) ed anche glucagone-like peptide-1 (GLP-1) e insulina 4, Pertanto, negli studi in meccanismi regolatori di livelli di fame e sazietà peptidici sono spesso valutata e, allo stesso tempo, si presume che il peptide studiato è stabile e recuperato con rese elevate durante la formazione del plasma. Spesso, tuttavia, questo non è il caso a causa della rapida composizione endogena come indicato in precedenza per es. grelina che viene degradata da acile a desacyl grelina 5. Pertanto, abbiamo recentemente descritto il metodo rapido per proces sanguecantare in ratti che impiegano temperature R educed, A cidification, P rotease inibizione, ho sotopic controlli esogeni e D ilution 6. Questo metodo migliorato recupero per 6 11 di 12 peptidi testati e consentiti per la determinazione della forma molecolare circolante corretta rispetto al trattamento del sangue standard (sangue EDTA su ghiaccio). Questo metodo è stato utilizzato in diversi studi successivi 7-12 per la rilevazione di grelina circolante e dal fattore di rilascio della corticotropina 13. Pertanto, il metodo si è dimostrato utile per la ricerca peptide nei roditori. Tuttavia, dal momento che studi su roditori non sono sempre traducibili ad un'altra specie, il metodo deve essere stabilito per l'uso nel sangue umano pure.
Lo scopo del presente studio è stato quello di testare il metodo rapido per il trattamento del sangue negli esseri umani rispetto al trattamento del sangue normale, il sangue EDTA sul ghiaccio, che è ampiamente consigliata 14 e frequentemente used nel così come ambiente di ricerca clinica. Abbiamo testato il recupero di una selezione di 125 peptidi I-etichettati coinvolti nella regolazione dell'assunzione di cibo tra cui peptidi stabiliti così come nuovi candidati recentemente suggerito di svolgere un ruolo nell'alimentare regolamento (effetti sulla assunzione di cibo sono riportati nella tabella 1) dopo la trasformazione con entrambi i metodi. Ormoni stati scelti anche rappresentare peptidi di lunghezza e di carica (Tabella 2) differente. Inoltre, per grelina abbiamo studiato la forma molecolare (s) seguendo il metodo standard e RAPID. Infine, abbiamo valutato la grelina endogena (acil e desacyl grelina), così come i livelli di kisspeptin, un peptide anche recentemente suggerito di svolgere un ruolo nella regolazione dell'assunzione di cibo 15,16 seguente trasformazione RAPID o standard. Inoltre, abbiamo anche studiato questi livelli di peptide in una popolazione di soggetti con una vasta gamma di indice di massa corporea (che vanno 10,2-67,6 kg / m 2) per studiare possibLe differenze relative al peso corporeo cronicamente alterato.
La diagnosi, valutazione, e Piano:
I partecipanti allo studio
Tutti i partecipanti allo studio sono stati recentemente pazienti ricoverati (inclusione era entro due giorni di ricovero in ospedale) della Divisione di Medicina Psicosomatica a Charité-Universitätsmedizin Berlino e ha dato consenso informato scritto. Per evitare qualsiasi impatto del genere solo pazienti di sesso femminile sono stati inclusi. Un totale di 42 soggetti hanno partecipato a questo studio e sono stati divisi in tre gruppi: peso normale (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anoressia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) e obesità (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). pazienti obesi Anorexic e sono statidiagnosticata secondo la classificazione internazionale delle malattie-10 e ricoverati in ospedale per l'aumento di peso (anoressia nervosa) o la riduzione del peso (obesità), rispettivamente. Tutti i pazienti di peso normale sono stati ricoverati esclusivamente a causa di sintomi somatoformi senza rilevanti disturbi somatici. Sono stati esclusi i pazienti con sintomi somatoformi gastrointestinali o una storia di chirurgia gastrointestinale. I criteri di esclusione comprendevano anche un'età <18 anni, gravidanza in corso e le malattie psicotiche non trattati. Il prelievo di sangue è stata eseguita il giorno 2 o 3 dopo il ricovero in ospedale prima del trattamento dietetico per aumentare o ridurre il peso corporeo, rispettivamente. parametri antropometrici sono stati valutati nello stesso giorno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo segnalato in precedenza che il metodo rapido per il trattamento del sangue migliorato il recupero per 11/12 peptidi rispetto al trattamento del sangue standard per ratti 6. Nel presente studio abbiamo dimostrato che questo metodo è anche adatto per l'uso nell'uomo. Dopo l'elaborazione RAPID, il recupero per 9 di 9 125 peptidi marcati I-testato è stato migliorato rispetto al trattamento del sangue standard (EDTA di sangue sul ghiaccio). Il miglioramento osservato variava 19-39%…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione tedesca per la ricerca STE 1765 / 3-1 (AS) e Ministero tedesco dell'Istruzione e della ricerca 03IPT614A (CG). Ringraziamo Reinhard Lommel e Petra Buße per la loro eccellente supporto tecnico, così come Karin Johansson e Christina Hentzschel aiuto per l'organizzazione e l'esecuzione di misure antropometriche
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
Riferimenti
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