Eine schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Ausbeute an Plasma-Peptidkonzentrationen im menschlichen Blut zu erhöhen
Summary
Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen eingesetzt werden und liefert höhere Peptidspiegel sowie ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form. Daher wird dieses Verfahren ein wertvolles Werkzeug in der Peptid Forschung sein.
Abstract
Die Forschung im Bereich der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Dazu gehört oft die Messung von Peptiden Regulierung der Nahrungsaufnahme. Für die korrekte Bestimmung der Konzentration des Peptids, sollte es während der Blutverarbeitung stabil sein. Dies ist jedoch nicht der Fall für mehrere Peptide, die durch endogene Peptidasen schnell abgebaut werden. Vor kurzem haben wir eine Blutverarbeitungsverfahren unter Verwendung von R educed Temperaturen entwickelt, A cidification, rotease P Hemmung, I sotopic exogenen Kontrollen und D ilution (RAPID) für die Verwendung in Ratten. Hier haben wir diese Technik für den Einsatz beim Menschen festgestellt und untersucht Erholung, molekulare Form und zirkulierende Konzentration der Nahrungsaufnahme regulatorischen Hormone. Die RAPID Verfahren erheblich verbessert die Erholung für 125 I-markierte Somatostatin-28 (+ 39%), Glucagon-like Peptid-1 (+ 35%), Acyl- Ghrelin und Glukagon (+ 32%), Insulin und kisspeptin (+ 29% ), nesfatin-1 (+ 28%), Leptin(+ 21%) und Peptid YY 3-36 (+ 19%) im Vergleich zu Standard – Verarbeitung (EDTA – Blut auf dem Eis, p <0,001). Hochleistungsflüssigkeitschromatographie zeigte die Elution von endogenen Acyl Ghrelin an der erwarteten Position, nachdem eine schnelle Verarbeitung, während nach Standardverarbeitungs 62% der Acyl Ghrelin abgebaut wurden in einem früheren Peak resultierende Wahrscheinlichkeit darstellt Desacyl Ghrelin. Nach dem schnellen Verarbeitung der Acyl- / Desacyl Ghrelin – Verhältnis im Blut von normalen gewichtigen Probanden betrug 1: 3 im Vergleich zu 1.23 folgende Standardverarbeitung (p = 0,03). Auch endogene kisspeptin Werte waren höher nach RAPID Vergleich zu Standardverarbeitung (+ 99%, p = 0,02). Die RAPID Blutverarbeitungsverfahren kann beim Menschen verwendet werden, ergibt höhere Peptidspiegel und ermöglicht die Beurteilung der richtigen molekularen Form.
Introduction
Angesichts der weltweit zunehmenden Verbreitung von Fettleibigkeit 1,2, Forschung auf dem Gebiet der Nahrungsaufnahme Regulierung gewinnt zunehmend an Bedeutung. Während bisher nur ein Peptid bekannt ist , dass peripher produziert und wirkt zentral Nahrungsaufnahme zu stimulieren, nämlich Ghrelin 3, in den letzten Jahrzehnten hat sich ein breites Spektrum von Peptiden worden , die Aufnahme zu reduzieren Lebensmittel identifiziert, z. B. Leptin, Peptid YY (PYY) und auch Glucagon-like peptide-1 (GLP-1) und Insulin – 4 daher in Studien , die die Regulationsmechanismen von Hunger und Sättigung Peptidspiegel sucht werden oft beurteilt und zugleich wird angenommen , dass das Peptid untersucht ist stabil und mit hoher Ausbeute während der Plasmabildung wiedergewonnen. Doch sehr oft ist dies nicht der Fall aufgrund der schnellen endogenen Abbau nach wie vor für zB gezeigt. Ghrelin , die aus Acyl abgebaut wird Ghrelin 5 bis Desacyl. Deshalb haben wir beschrieben, vor kurzem die schnelle Methode zur Blut VorarbVerwendung von R educed Temperaturen bei Ratten singen, A cidification, rotease P Hemmung, ich sotopic 6 exogene Kontrollen und D ilution. Dieses Verfahren verbessert die Erholung für 11 von 12 Peptiden getestet und für die Bestimmung des richtigen zirkulierende molekularer Form im Vergleich zu Standardblutverarbeitung (EDTA – Blut auf Eis) erlaubt 6. Dieses Verfahren wurde in mehreren nachfolgenden Studien 7-12 zur Detektion von zirkulierenden Ghrelin sowie Corticotropin-Releasing – Faktor 13 verwendet. Daher hat das Verfahren für die Peptidforschung in Nagetieren als nützlich erwiesen. da Nagetier Studien sind jedoch nicht immer übersetzbar zu anderen Spezies, soll das Verfahren auch für die Verwendung im menschlichen Blut hergestellt werden.
Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die schnelle Methode zur Blutverarbeitung beim Menschen im Vergleich zu Standard – Blutverarbeitung, EDTA – Blut auf dem Eis zu testen, die weit 14 empfohlen und häufig uin der klinischen sowie Forschungs Einstellung sed. Wir testeten die Wiederherstellung einer Auswahl von 125 I-markierten Peptiden in der Regulation der Nahrungsaufnahme einschließlich etablierten Peptide beteiligt sowie neue Kandidaten vor kurzem in der Fütterung Regulierung eine Rolle zu spielen vorgeschlagen folgende Verarbeitung (Auswirkungen auf die Nahrungsaufnahme sind in Tabelle 1 gezeigt) mit beiden Methoden. Hormone wurden auch verwendet, um Peptide von unterschiedlicher Länge und Ladung (Tabelle 2) ausgewählt. Darüber hinaus für Ghrelin untersuchten wir die molekularen Form (en) nach dem Standard und schnelle Methode. Schließlich wir endogene Ghrelin (acyl und Desacyl Ghrelin) sowie kisspeptin Ebenen bewertet, ein Peptid , auch vor kurzem vorgeschlagen , eine Rolle bei der Regulation der Nahrungsaufnahme 15,16 folgenden RAPID oder Standard – Verarbeitung zu spielen. Darüber hinaus untersuchten wir auch diese Peptid – Werte in einer Population von Patienten mit einer breiten Palette von Body – Mass – Index ( im Bereich von 10,2 bis 67,6 kg / m 2) possib zu studierenle Unterschiede zu chronisch veränderte Körpergewicht bezogen.
Diagnose, Bewertung und Plan:
Die Studienteilnehmer
Alle Studienteilnehmer wurden neu Patienten im Krankenhaus (Aufnahme innerhalb von zwei Tagen nach der Aufnahme ins Krankenhaus war) der Abteilung für Psychosomatische Medizin an der Charité-Universitätsmedizin Berlin und gab informierte Zustimmung geschrieben. Um zu vermeiden, wurden keine Auswirkungen von Geschlecht nur weibliche Patienten eingeschlossen. Insgesamt 42 Probanden nahmen an dieser Studie und wurden in drei Gruppen eingeteilt: Normalgewicht (BMI 18,5 bis 25 kg / m 2, n = 12), Anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) und Adipositas (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorexic und adipösen Patienten warennach der Internationalen Klassifikation der Krankheiten-10 diagnostiziert und für die Gewichtszunahme (Anorexia nervosa) oder Gewichtsreduktion (Adipositas), die jeweils im Krankenhaus. Alle Normalgewicht Patienten wurden ausschließlich auf somatoforme Symptome ohne relevante somatische Störungen ins Krankenhaus. Patienten mit Magen-Darm-somatoforme Symptome oder einer Vorgeschichte von Magen-Darm-Chirurgie wurden ausgeschlossen. Ausschlusskriterien umfassten auch ein Alter <18 Jahre, aktuelle Schwangerschaft und unbehandeltem psychotischen Erkrankungen. Die Blutentnahme wurde am Tag 2 oder 3 nach Einlieferung ins Krankenhaus durchgeführt, bevor diätetischen Behandlung, um Aufnahmekörpergewicht zu erhöhen oder zu verringern, beziehungsweise. Anthropometrische Parameter wurden am selben Tag untersucht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir berichteten vor , dass die schnelle Methode zur Blutverarbeitung die Erholung für 12.11 Peptide im Vergleich zu Standardblutverarbeitung bei Ratten verbessert 6. In der vorliegenden Studie haben wir gezeigt, dass dieses Verfahren auch für die Anwendung beim Menschen geeignet ist. Im Anschluss an eine schnelle Verarbeitung, die Erholung für 9 von 9 125 I-markierten Peptiden getestet wurde verbessert im Vergleich zu Standard – Blutverarbeitung (EDTA – Blut auf Eis). Die beobachtete Verbesserun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Deutsche Forschungsgemeinschaft STE 1765 / 3-1 (AS) und Bundesministerium für Bildung und Forschung 03IPT614A (CG) unterstützt. Wir danken Reinhard Lommel und Petra Buße für ihre hervorragenden technischen Support sowie Karin Johansson und Christina Hentzschel für die Hilfe bei Organisation und Durchführung von anthropometrische Messungen
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
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