Kan işleme için hızlı bir yöntem insan kanı plazma peptid düzeylerinin veriminin arttırılması için
Summary
Hızlı kan işleme yöntemi, insanlarda kullanılan ve daha yüksek peptit seviyelerini veren ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için sağlar edilebilir. Bu nedenle, bu yöntem peptid araştırmalarında değerli bir araç olacaktır.
Abstract
gıda alımı düzenleme alanındaki araştırmalar önem kazanmaktadır. Bu genellikle gıda alımını düzenleyen peptidlerin ölçümü yapılacaktır. Bir peptidin konsantrasyonu, doğru belirlenmesi için, kan işleme sırasında dayanıklı olması gerekir. Bununla birlikte, bu hızla endojen peptidazlar tarafından parçalanan çok peptidler için durum böyle değildir. Son zamanlarda, biz Ar educed sıcaklıkları, Bir cidification kullanan bir kan işleme yöntem geliştirdi, P eksojen kontrolleri ve sıçanlarda kullanmak için D ilution (HIZLI) sotopic, inhibisyon rotease. Burada, insanlarda kullanım için, bu teknik tesis ve kurtarma, moleküler form ve gıda alımı, düzenleyici hormon dolaşımdaki konsantrasyonunu araştırdık. Hızlı yöntem önemli ölçüde 125l-etiketli somatostatin-28 (+% 39), glukagon benzeri peptit-1 (+% 35) için kurtarma, asil ghrelin ve glukagon (+% 32), insülin ve Kisspeptin (+% 29 geliştirilmiş ), nesfatin-1 (+% 28), leptin(+% 21) ve standart işleme (buz üzerinde EDTA kan, p <0.001) peptid YY 3-36 (+% 19). Standart işlemden sonra asil ghrelin% 62 olasılıkla desasil ghrelin temsil önceki bir tepe elde bozulmuş ise yüksek performanslı sıvı kromatografisi, hızlı işlenmesi sonra istenen pozisyonda endojen asil grelin elüsyon göstermiştir. Standart işleme (p = 0.03) Aşağıdaki 1:23 ile karşılaştırıldığında 3: HIZLI işlendikten sonra normal kilolu bireylerde kandaki asil / desasil ghrelin oranı 1 oldu. Ayrıca endojen Kisspeptin seviyeleri standart işleme kıyasla, hızlı sonrası daha yüksek (+% 99, p = 0.02). Hızlı kan işleme yöntemi insanlarda kullanılabilir yüksek peptid seviyeleri verir ve doğru moleküler biçiminin değerlendirilmesi için izin verir.
Introduction
Obezitenin 1,2 dünya çapında giderek yaygınlaşması ışığında, gıda alımı düzenleme alanında araştırma önem kazanmaktadır. Şimdiye kadar sadece bir peptit periferik üretilen bilinmektedir ve merkezi geçmiş yıl içinde, gıda alımını, yani ghrelin 3 uyarmak için hareket ederken, peptidler geniş bir yelpazede, örneğin, gıda alımını azalttığı tespit edilmiştir. Leptin, peptid YY (PYY) ve glukagon-benzeri peptit-1 (GLP-1) ve insülin 4 Bu nedenle, açlık ve tokluk peptit seviyelerinin düzenleyici mekanizmaların araştıran çalışmalarda genellikle değerlendirilir, aynı zamanda, kabul edilir çalışılan peptid stabil ve plazma oluşumu sırasında, yüksek verimlerle geri alınacak. Eg önce gösterildiği gibi Ancak, çok sık bu durum hızlı endojen arıza durum böyle değil. ghrelin 5 desasil için asil, parçalanır ghrelin. Bu nedenle, son zamanlarda kan işlenme HIZLI yöntemi tarifR educed sıcaklıkları, bir cidification kullanılarak sıçanlarda şarkı, P dışsal kontrol ve D ilution 6 sotopic inhibisyonu rotease. Bu yöntem, 11 12 peptidlerinin test edilmiş ve (buz üzerinde EDTA kan) standart kan işleme göre doğru dolaşan moleküler biçimde belirlenmesi için izin verilen 6 iyileşme gösterilmektedir. Bu yöntem, kortikotropin salıveren faktör 13 gibi grelin sirküle saptanması için sonraki birçok araştırmada 7-12 kullanılmıştır. Bu nedenle, yöntem, kemirgenlerde peptid araştırma için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Kemirgen çalışmaları başka türden her zaman çevrilebilir değildir Bununla birlikte, yöntem, aynı zamanda, insan kanında kullanım için oluşturulmalıdır.
Bu çalışmanın amacı, yaygın 14 ve sık sık u tavsiye edilir standart kan işleme, buz üzerinde EDTA kan ile karşılaştırıldığında insanlarda kan işleme HIZLI yöntemi test etmek olduKlinik yanı sıra araştırma ortamında sed. Son zamanlarda, aşağıdaki işleme (gıda alımı üzerine etkileri Tablo 1'de gösterilmiştir) düzenlenmesi besleme bir rol oynadığı düşünülmektedir oluşturulan peptidler ve yeni aday dahil olmak üzere gıda alımının düzenlenmesi yer 125I-işaretli peptidlerin seçimi kurtarma test Her iki yöntem ile. Hormonlar, farklı uzunluk ve şarj (Tablo 2) peptidleri temsil eden seçilmiştir. Ayrıca, ghrelin için biz standart ve HIZLI metodu izleyerek moleküler formu (ler) araştırıldı. Son olarak, endojen grelin (asil ve desasil grelin) yanı sıra Kisspeptin seviyeleri, aynı zamanda en son HIZLI ya da standart işlem, aşağıdaki yiyecek alımı 15,16 düzenlenmesinde önemli bir rol oynadığı düşünülmektedir bir peptit değerlendirildi. Buna ek olarak, biz de possib incelemek için (10,2-67,6 kg arasında değişen / m 2) vücut kitle indeksi geniş bir yelpazede konular nüfusu bu peptid seviyeleri incelendiKronik değişmiş vücut ağırlığına bağlı le farklar.
Tanı, Değerlendirme ve Plan:
Çalışmaya katılanlar
Tüm çalışma katılımcıları yeni Charité-Universitätsmedizin Berlin Psikosomatik Tıp Bölümü (içerme hastaneye yatış iki gün içinde oldu) hastaları hastaneye ve yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. cinsiyet herhangi bir etkisi yalnızca kadın hasta dahil edildi önlemek için. 42 denek toplam Çalışmaya katılan ve üç gruba ayrıldı: normal kilolu (BMI 18,5-25 kg / m2, n = 12), anoreksiya nervoza (VKİ <17.5 kg / m2, n = 15) ve obezite (BMI> 30 kg / m2, n = 15). Anoreksik ve obez hastalar vardıHastalıkların-10 Uluslararası Sınıflandırması göre tanı ve sırasıyla kilo (anoreksiya nervoza) ya da kilo (obezite), hastanede. Tüm normal kilolu hastalar nedeniyle ilgili somatik bozukluklar olmadan somatoform belirtiler münhasıran hastaneye kaldırıldı. Gastrointestinal somatoform belirti veya gastrointestinal cerrahi öyküsü olan hastalar çalışma dışı bırakıldı. Dışlama kriterleri de bir yaş <18 yıl, mevcut gebeliği ve işlenmemiş psikotik hastalıklar kapsıyor. Kan toplama artırmak veya sırasıyla, vücut ağırlığını azaltmak için diyet tedavisi almadan önce hastaneye yat gün sonra 2 veya 3 gerçekleştirildi. Antropometrik parametreler aynı gün değerlendirildi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kan işleme HIZLI yöntem sıçanlarda 6 standart kan işleme göre 11/12 peptidler için kurtarma geliştirilmiş bundan önce bildirmiştir. Bu çalışmada, bu yöntem, aynı zamanda, insanlarda kullanım için uygun olduğunu göstermiştir. HIZLI işleme ardından, test 9 125 9-etiketli peptidler için kurtarma standart kan işleme (buz üzerinde EDTA kan) göre geliştirilmiştir. gözlemlenen gelişme, özellikle peptid verimi düşük olduğunda maskelenebilir olabilecek tek ince farklar be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Eğitim ve Araştırma 03IPT614A (CG) Alman Araştırma Vakfı STE 1765 / 3-1 (AS) ve Alman Bakanlığı tarafından desteklenmiştir. Biz organizasyon ve antropometrik ölçümler yürütülmesi konusunda yardım için Reinhard Lommel ve Petra Busse mükemmel teknik destek yanı sıra Karin Johansson ve Christina Hentzschel teşekkür
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
Riferimenti
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
