An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Tüm yeni nesil dizileme (NGS) prosedürleri biyoinformatik boru hatları ( "kuru tezgah") kullanılarak gerçekleştirilmiştir analizleri ( "ıslak tezgah") ve veri laboratuar tezgah yapılan tahliller yer alıyor. Her iki element klinik laboratuvarlar için özellikle kritik olan doğru ve güvenilir sonuçlar üretmek için gereklidir. Hedeflenen NGS teknolojileri giderek önceden hassas ilaç hedeflerine ulaşmasına yardımcı olmak için onkoloji uygulamalarında lehine bulduk, ama yöntemler genellikle kesilir ve ıslak ve kuru tezgah iş akışları ve koordinasyonsuzluk reaktif setleri değişkendir barındırır. Bu yazıda, dizi kapsamlı hedef NGS sisteminin bir örnek olarak, 21 gen paneli olan kanser örnekleri zorlu için bir yöntem tarif eder. Sistem bağımsız biyoinformatik paketi ile analitik-doğrulanmış, tek kaynaklı reaktifler kullanılarak fonksiyonel DNA miktarının ve yeterlilik, tek tüp mültipleksli PCR zenginleşme ve kütüphane arınma ve normalleşme bütünleştirir.Sonuç olarak, doğru varyantı aramalar düşük kaliteli ve düşük miktar formalin ile fikse, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) tümör biyopsileri elde edilebilir. yöntem rutin 400 çoğaltılabilir DNA kopyası bir girişten kanserle ilişkili varyantları değerlendirmek ve yeni gen içeriğine uygun olarak tasarım modüler olduğunu. analitik tanımlanmış kontroller iki farklı türde klinik olarak ilgili örnekleri ile kalite güvencesi ve yardım koruma çağrısı doğruluğunu sağlamak. Esnek "etiket" PCR adımı ortak tezgah NGS enstrümanları ile örnek barkod ve uyumluluk sağlamak için platforma özel adaptörler ve endeks kodlarını gömer. Önemlisi, protokol aerodinamik ve tek bir gün içinde 24 dizi hazır kütüphaneleri üretebilir. Son olarak, yaklaşım mutasyon tespit doğruluğunu geliştirmek ve yalancı negatif ve indeterm ayırt etmek için algoritmalar çağıran varyantı doğrudan pre-analitik numune kalite kontrol sonuçları birleştirerek ıslak ve kuru tezgah süreçlerini bağlantılarrafinat aramalar. Bu hedef NGS yöntemi wetware ve yüksek derinlik, çoklanmış sıralama ve teşhis uygulamaları için heterojen kanser örneklerinin hassas analiz elde etmek yazılım hem de gelişmeleri kullanmaktadır.
Hassas tıp hastaları için tanı ve tedavi seçenekleri bireyselleştirilmesi dayanır. özel tedavilerin söz moleküler tanı ve hedefli tedavilerin bağlantıyı bilgilendirebilir hastalık yollarının daha iyi anlaşılması doğrudan bir sonucudur. Örneğin, moleküler hedefli tedavilerin kullanılması 2013 1 2003 den% 46% 11 yükselmiştir ve vemurafenib ve krizotinib gibi anti-kanser ilaçları arkadaşı tanısal testler ile FDA silinir. doğru son derece çoklanmış örnek setleri arasında düşük bolluk dizisi hedefleri kurtarmak için onun yeteneği ile yeni nesil dizileme (NGS) kanseri ile ilişkili genetik anormallikleri değerlendirmek ve hassas tıp moleküler hedeflerin belirlenmesi için tercih edilen bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır.
Moleküler test için en yaygın solid tümör biyopsileri formalin ile fikse dahil, parafine gömülü (FFPE) ve ince iğne aspirasyon (FNA) specimens. Bu örnekler, düşük miktar ve / veya düşük kaliteli doğru NGS 2-5 kıymetlendirmeler meydan nükleik asitler ile doludur. Bu örneklerin analizi için günümüzde piyasada NGS yöntemleri farklı reaktifler, protokoller ve sürekli iyileştirmeler hareketli hedefleri temsil bilişim araçları patchwork dayanmaktadır. Örneğin, tahlil kimyaları ve / veya yazılım değişiklikleri en sık kullanılan hedef NGS kitleri 6 her 1-2 ayda bir meydana geldi. Bu istikrarsızlık oluşturmak ve özellikle kanser testi için, zorlu örnek türleri için bir birleşik NGS sistemi doğrulamada tutarlılık eksikliği yansıtır ve örnek-to-sonuçlarından optimize edilmiştir yapışkan protokolleri geliştirmek için laboratuvarlar üzerine aşırı yük koyar. Nitekim, NGS kullanıcılarından biri son anket kurulan tıbbi dava içerik, kemikleşmiş biyoinformatik uzmanlığı, bir solidifi için gereksinimleri ile birlikte, bu "hızlı değişen" teknolojileri zorluklar vurgulananişbaşı eğitim 7 kolaylaştıran ed ve hızla uygulanabilir entegre prosedür ve aerodinamik iş akışları ve basitleştirilmiş protokolleri. Bu makalede, hedeflenen NGS için kapsamlı bir sistem bu boşlukları giderir tarif edilmektedir.
sunulan metodoloji klinik ile ilgili kanser geni loci NGS için hedef ölçümü ve algılama doğruluğu, duyarlılığı ve güvenilirliğini artırmak için ıslak ve kuru hem banklar pre-analitik post-analitik tüm prosedürel adımlar bütünleştirir. Bu yaklaşım, DNA kalitesini değerlendirmek çok düşük şablon kopya sorgulama kaynaklanabilecek yanlış pozitif çağrılarına karşı PCR zenginleştirme aşamasında girdi ve bekçi rehberlik "işlevsel" DNA 4 miktarının ile başlar. Tek tüp multipleks PCR sonra NGS usin için platforma özel dizilerinin katılmasıyla ardından, sadece 400 çoğaltılabilir DNA kopyalarını kullanarak 46 lokus 21 kanser genleri için zenginleştiriyorg ortak bir masaüstü sıralama aletleri. Kütüphaneler basit bir manyetik boncuk prosedür kullanılarak saflaştırılmış ve bir roman, kalibrasyon gerektirmeyen qPCR testi ile ölçülür. Çağrı performansını artırmak için örnek DNA QC sonuçları haberdar Bir bağımsız biyoinformatik paketi, NGS aşağıdaki dizisi analiz sağlar. Biz baz ikame mutasyonlar, ekleme / silmeler (indeller) ortaya çıkarmak için hedeflenen NGS için bu sistem yaklaşımı kullanarak verileri sunmak ve sayısı, FFPE ve İİA örneklerinde ve çalışma gibi düşük kaliteli ve düşük miktar tümör biyopsilerinde (CNVs) varyantları kopyalama kontrol eder.
NGS teknolojileri klinik ortamlarda 9 tümör biyopsisi moleküler profillerini sorgulamak için beklentileri yeniden tanımlamıştır. Hedeflenen NGS panellerin bir dizi klinik örneklerden 3,5,10-15 çok tip değerlendirmek için araştırma teknolojileri, laboratuvar geliştirilen testler ve piyasada bulunan ürünler ve özel panelleri gibi geliştirilmiştir. Birden fazla çalışmaların raporları genomik değişikler 3,10-12,14 saptanması için hassas ve özgün bir klinik bir araç gibi NGS değeri göstermiştir. Oysa çalışmalar aynı zamanda FFPE 2-5,12,14 örneklerinde olduğu gibi zorlu kanser biyopsilerinden yanlış pozitif sonuçlara neden olabilir eserler riskini göstermiştir. Buna ek olarak, yeni yayınlar düşük giriş DNA 12 kullanımı ile ağırlaştırılmış ticari hedeflenen NGS panelleri ile 16 ve yalancı pozitif aramalar onkoloji kullanarak NGS için yüksek başarısızlık oranları numuneler sermiştir. Bunun bir sonucu olarak, bazı laboraMuhafazakârlar ya değiştirilmiş ya da ticari olarak temin hedeflenen NGS teknolojileri doğruluğunu sağlamak veya biyoinformatik 5,10,11 analizleri bulguları doğrulamak için sık sık, performansını artırmak için ek kontroller ve dengeler ekledik.
21-gen paneli (Şekil 2) gibi FFPE ve FNA tümör biyopsisi gibi zorlu örnek türlerinde kanıta dayalı, eyleme mutasyonlar sorgulamak için kapsamlı bir NGS sistemi için hedeflenen içerik olarak geliştirilmiştir. Iş akışı bir dizi fayda vardır: üniforma amplikon kapsama (Şekil 3 ve 4, Tablo 3) sağlayarak 1) tutarlılık; 2) kolaylığı kullanımı sağlayarak, optimize edilmiş reaktif setleri önceden formüle ve biyoinformatik gereksinimleri basitleştirilmesi; iş akışını kolaylaştırarak ve diğer ticari NGS yöntemlere kıyasla pipetle çalışma aşamasına sayısını azaltarak 3) verim; Amplifi değerlendirmek için bir DNA QC tahlil birleştirerek ve 4) doğruluğumümkün DNA kopya sayısı kabul edilebilir şablon çeşitliliği sağlamak ve varyant tespiti 4 stokastik dalgalanmaları önlemek için. biyoinformatik analizi ile pre-analitik QC verilerinin entegrasyonu FFPE DNA'nın düşük girişler için izin verir. Bu gerçeğin bağımsız önlemlerle 400 FFPE örneklerinin arasında DNA girişi farklı işlevsel kopyalarını kullanarak bir karar ağacı algoritması eğitim ve biyoinformatik yazılımı içine bu algoritmayı katarak elde edildi. Bunun bir sonucu olarak, FFPE DNA ~ 5-20 ng tipik olarak eşdeğer 400 amplifiye kopyalarının önerilen girişi, FFPE DNA ~ 250 ng 17,18 önerilir melezleştirme tabanlı zenginleştirme dahil olmak üzere diğer yöntemler 10-12 ile karşılaştırıldığında olumlu . teknik MiSeq platformu üzerinde kullanım için tarif edilmiş olmasına rağmen, diğer NGS platformlarda dizi analizi sağlamak için cihaza özel bağdaştırıcılar etiketleyin PCR primerleri kullanılarak modifiye edilebilir.
Birkaç adım başarı sağlamak için kritik öneme sahiptirusul. pre-analitik QC tahlil DNA ve raporlar fonksiyonel inhibisyonu büyütülebilir kopya sayısını belirler. 400'den az amplifikasyona tabi tutulabilen DNA kopyası PCR zenginleştirme aşamasında kullanılan, ancak, düşük yoğunluklu mutasyonlar ile numune bir yalancı negatif çağrısı (Şekil 6) bir artış riski vardır. Buna ek olarak, bakım yıkama veya yıkama aşamaları sırasında manyetik boncuk aşırı kurumasını önlemek için kütüphane saflaştırma sırasında alınmalıdır. Bundan başka, başarılı bir kütüphane miktar kütüphane DNA doğru seyreltme oldukça bağımlıdır. En iyi sonuç için, qPCR farkı ≤3.3 Cq olmalıdır örnek kütüphane LQ Standardı (Cq VIC) ile karşılaştırıldığında (Cq FAM) için sonuçları. farklılık daha büyük 3.3 Cq yeniden seyreltme ve numunenin test ise tavsiye edilir. mükemmel bir ilişki, bu rekabetçi qPCR yöntem ve ticari kitler ile gözlenmiştir, ancak bir standart eğri kullanılarak, mutlak kantifikasyon sunanDiğer yöntemler, klonal amplifikasyon aşaması, nispeten kitaplık giriş ofset optimal tohum yoğunluğu elde etmek için gerekli olabilir.
Bazı kanser örnekleri, özellikle çünkü DNA izolasyonu sonra devam inhibitörlerinin sıralamak için zorlamaktadır. Kütüphane hazırlık öncesinde bu örnekleri belirlemek için, qPCR QC deneyi de bir iç kontrol ve fonksiyonel inhibisyonu için bir nöbetçi hem de hizmet veren bir eksojen şablonu dahil ederek amplifikasyon inhibe algılar. Sözgelimi, bir melanom, DNA örneği mt önceden sekanslama QC inhibisyonu geçemediğini ve daha sonra dizisi çıkarıldı edilebilir bir kitaplık oluşturmak için başarısız olan Şekil 3'te gösterilmektedir. arıza olasılığı FFPE DNA izolasyon aşamasından taşınan melanin kirlenme, bilinen bir PCR inhibitörü, bir sonucudur. QC tahlili ile tespit numuneler ekstra temizlik adım t yoluyla kurtarılabileceği edilebilir amplifikasyon yetmezliği riski altında olduğuo potansiyel inhibitörleri kaldırın.
Hedeflenen 21-gen paneli kanıta dayalı gen noktaları üzerinde duruluyor ve DNA QC, pre-analitik "işlevsel" DNA miktar sonuçları tarafından bilgilendirilir NGS ve biyoinformatik yazılımı için optimize edilmiş reaktifler ve kontrolleri ile komple bir sistem sağlar. yöntem doğru düşük giriş DNA'dan baz ikame mutasyonlar ve indellerin algılar ve bu CNVs gibi ek türevlerini algılamak için ve hedeflenen RNA sıralaması için adapte edilebilir, panel içeriği genişletmek için seçeneği ile bir NGS sisteminin bir örnek sağlar.
The authors have nothing to disclose.
Biz yazının incelenmesi için Dr. Annette Schlageter teşekkür ederim. Bu çalışma Kanser Önleme ve Texas Araştırma Enstitüsü (: GJL PI) hibe CP120017 tarafından kısmen desteklenmiştir.
2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
ROX | Asuragen | 145346 | |
Diluent | Asuragen | 145339 | |
DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
AIL001 – AIL048 (48) | |||
Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
AIL049 – AIL096(48) | |||
2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
Illumina MiSeq | Illumina | ||
MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
Quantidex Reporter Software | Asuragen |