Integrazione di Wet and Dry processi banco Ottimizza Targeted sequenziamento di prossima generazione di bassa qualità e di biopsie di tumori a bassa quantità
Summary
An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Abstract
Tutte le procedure di sequenziamento di prossima generazione (NGS) comprendono esperimenti eseguiti presso il banco di laboratorio ( "bench bagnato") ei dati analisi condotte utilizzando bioinformatica condotte ( "banco secco"). Entrambi gli elementi sono essenziali per produrre risultati precisi e affidabili, che sono particolarmente critico per laboratori clinici. tecnologie NGS mirate hanno sempre trovato grazia in applicazioni di oncologia per aiutare gli obiettivi della medicina precisione anticipo, ma i metodi spesso comportano scollegato e variabili i flussi di lavoro banco umido e secco e set di reagenti non coordinate. In questa relazione, si descrive un metodo per il sequenziamento impugnare campioni di cancro con un pannello 21-gene come un esempio di un sistema NGS mirato completo. Il sistema integra quantificazione funzionale del DNA e la qualificazione, a tubo singolo multiplex arricchimento PCR, e la purificazione biblioteca e la normalizzazione utilizzando analiticamente-verificati, reagenti singolo-source con una suite bioinformatica standalone.Di conseguenza, la variante preciso chiamate da bassa qualità e basso-quantità fissati in formalina, incluso in paraffina (FFPE) e agoaspirato (FNA) biopsie di tumori possono essere raggiunti. Il metodo può ordinariamente valutare le varianti di cancro-associata da un ingresso di 400 copie di DNA amplificabile, e ha un design modulare per accogliere nuovi contenuti gene. Due diversi tipi di controlli analiticamente definiti forniscono una garanzia di qualità e la salvaguardia di accuratezza delle chiamate con i campioni clinicamente rilevanti. A "tag" step PCR flessibile incorpora adattatori specifici della piattaforma e dei codici di indice per consentire codici a barre campione e la compatibilità con i comuni da banco strumenti NGS. È importante sottolineare che il protocollo è snella e in grado di produrre 24 librerie sequenza-ready in un solo giorno. Infine, l'approccio collega processi banco umido e secco, integrando i risultati dei controlli pre-analitica qualità del campione direttamente nella variante chiamando algoritmi per migliorare la mutazione precisione del rilevamento e differenziare falsi negativi e indetermchiamate dere i. Questo metodo NGS mirata utilizza progressi sia in wetware e software per realizzare ad alta profondità, il sequenziamento e l'analisi multiplex sensibile dei campioni tumorali eterogenee per applicazioni diagnostiche.
Introduction
medicina di precisione si basa sulla individuazione di opzioni diagnostiche e terapeutiche per i pazienti. La promessa di trattamenti su misura è una conseguenza diretta di una migliore comprensione di percorsi malattia che può informare il collegamento di diagnostica molecolare e terapie mirate. Ad esempio, l'uso di terapie molecolarmente mirati è aumentata dal 11% al 46% 2003-2013 1, e farmaci anti-cancro, come vemurafenib e crizotinib sono approvato dalla FDA con test diagnostici da compagnia. Con la sua capacità di recuperare con precisione gli obiettivi sequenza a bassa abbondanza attraverso set di campioni altamente multiplex, sequenziamento di prossima generazione (NGS) è emerso come un metodo di scelta per la valutazione aberrazioni genetiche associate con il cancro e identificare bersagli molecolari per la medicina di precisione.
Le biopsie di tumori solidi più comuni per i test molecolari sono fissati in formalina, incluso in paraffina (FFPE) e agoaspirato (FNA) SPECIMENS. Questi campioni sono carichi di bassa quantità e / o di bassa qualità acidi nucleici che sfidano accurata NGS a valutazioni 2-5. Gli attuali metodi di NGS commerciali per l'analisi di questi campioni si basano su un mosaico di diversi reagenti, protocolli e strumenti informatici che rappresentano bersagli in movimento di continui miglioramenti. Ad esempio, cambiamenti nella chimiche di analisi e / o software si sono verificati ogni 1-2 mesi per i più comunemente usati mirati NGS kit 6. Questa instabilità riflette una mancanza di coerenza nella costruzione e verifica di un sistema di NGS unificata per tipi di campioni difficili, in particolare per il test del cancro, e mette un onere eccessivo per i laboratori per lo sviluppo di protocolli coesivi che sono ottimizzati da campione a risultati. Infatti, una recente indagine di utenti NGS ha evidenziato le difficoltà di questi "rapida evoluzione" tecnologie, insieme con i requisiti per la stabilita, il contenuto medico-perseguibile, esperienza bioinformatica radicata, un solidifiED e procedura integrata che può essere implementata rapidamente, e razionalizzato i flussi di lavoro e protocolli semplificati che facilitano on-the-job training 7. In questo articolo, un sistema completo per mirato NGS è descritto che risponde a queste lacune.
La metodologia presentata integra tutte le fasi procedurali da pre-analitica di post-analitica a banchi sia umido e secco per migliorare l'accuratezza, la sensibilità e l'affidabilità di quantificazione di destinazione e di rilevamento per NGS di clinicamente rilevante loci gene del cancro. Questo approccio inizia con la quantificazione del DNA "funzionale" 4 per valutare la qualità del DNA, guidare in ingresso nella fase di arricchimento PCR, e la protezione contro le chiamate falsi positivi che possono derivare da l'interrogatorio di copie molto bassi di modello. Un multiplex monotubo PCR arricchisce poi per 46 loci in 21 geni del cancro usando solo 400 copie di DNA amplificabile, seguito da incorporazione di sequenze specifiche della piattaforma per NGS using desktop comuni strumenti di sequenziamento. Le biblioteche sono purificati mediante una semplice procedura tallone magnetico e quantificati con un romanzo, saggio qPCR senza calibrazione. Una suite bioinformatica standalone, informato dal campione risultati QC DNA per migliorare le prestazioni delle chiamate, fornisce analisi di sequenza seguente NGS. Vi presentiamo i dati che utilizzano questo approccio di sistema per il mirato NGS per rivelare mutazioni base-sostituzione, inserimento / delezioni (indels), e copiare il numero di varianti (CNV) nelle biopsie di bassa qualità e basso numero di tumori, come FFPE e campioni Fna e corsa controlli.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tecnologie NGS hanno ridefinito le aspettative per interrogare i profili molecolari di biopsie di tumori in ambito clinico 9. Un certo numero di pannelli NGS mirati sono stati sviluppati come tecnologie di ricerca, test di laboratorio sviluppato, e prodotti disponibili in commercio e pannelli personalizzati per valutare diversi tipi di campioni clinici 3,5,10-15. Rapporti da diversi studi hanno dimostrato il valore di NGS come strumento clinico sensibile e specifico per la rilevazione di alterazioni genomico 3,10-12,14. Ma gli studi hanno anche dimostrato il rischio di artefatti che possono causare risultati falsi-positivi da biopsie tumorali impegnative come FFPE campioni 2-5,12,14. Inoltre, recenti pubblicazioni hanno evidenziato elevati tassi di fallimento per NGS utilizzando oncologia provini 16 e falsi positivi chiamate con i pannelli commerciali NGS mirati che sono aggravati con l'uso di DNA a basso input 12. Come risultato, alcuni laboraTories hanno o modificati o aggiunti pesi e contrappesi supplementari per commercialmente disponibili tecnologie NGS mirate per migliorare le prestazioni, spesso per garantire l'accuratezza o confermare i risultati dalla bioinformatica analisi 5,10,11.
Il pannello 21-gene (Figura 2) è stato sviluppato come contenuto mirato per un sistema completo NGS per interrogare evidence-based, mutazioni attuabili in tipi di campioni impegnative come FFPE e biopsie di tumori FNA. Il flusso di lavoro ha una serie di vantaggi: 1) la coerenza, fornendo una copertura uniforme amplicone (figure 3 e 4, Tabella 3); 2) la facilità d'uso, fornendo pre-formulata, set di reagenti ottimizzati, e semplificando i requisiti di bioinformatica; 3) l'efficienza semplificando il flusso di lavoro e riducendo il numero di fasi di pipettamento rispetto ad altri metodi di NGS commerciali; e 4) la precisione incorporando un test del DNA di controllo di qualità per valutare l'amplificatorein grado numero di copie di DNA per garantire modello diversità accettabili ed evitare fluttuazioni stocastiche a rilevazione alla variante 4. L'integrazione dei dati QC pre-analitica con l'analisi bioinformatica consente basse ingressi FFPE DNA. Ciò è stato ottenuto con la formazione di un algoritmo decisionale albero utilizzando diverse copie funzionali di ingresso del DNA in tutto 400 campioni FFPE con misure indipendenti di verità, e incorporando questo algoritmo nel software bioinformatico. Di conseguenza, l'ingresso raccomandata di 400 copie amplificabile, tipicamente pari a ~ 5-20 ng di DNA FFPE, confronta favorevolmente ad altri metodi 10-12, arricchimento ibridazione a base cui si raccomanda ~ 250 ng di DNA FFPE 17,18 . Anche se la tecnica è descritta per l'uso su una piattaforma MiSeq, può essere modificato utilizzando tag primer PCR con adattatori specifici dello strumento per consentire l'analisi di sequenza su altre piattaforme NGS.
Diversi passaggi sono fondamentali per garantire il successodella procedura. Il test QC pre-analitica determina il numero di copie amplifiable del DNA e le relazioni di inibizione funzionale. Tuttavia, se vengono utilizzati meno di 400 copie di DNA amplificabile nella fase di arricchimento PCR, vi è un aumento del rischio di una chiamata falsi negativi da campioni con mutazioni a bassa abbondanza (Figura 6). Inoltre, bisogna fare attenzione durante la purificazione libreria per impedire l'eccessivo essiccamento delle perline magnetiche durante le fasi di lavaggio o eluizione. Inoltre, biblioteca successo quantificazione è fortemente dipendente dalla diluizione accurata di DNA library. Per il miglior risultato, la differenza della qPCR risultati per la libreria di campioni (Cq FAM) rispetto al LQ standard (Cq VIC) dovrebbe essere ≤3.3 Cq. Se la differenza è maggiore di 3,3 Cq, ri-diluizione e test del campione è raccomandato. Anche se un eccellente correlazione è stata osservata tra questo metodo qPCR competitivo e kit commerciali che offrono la quantificazione assoluta utilizzando una curva standard, Un offset dell'ingresso libreria nel clonale fase di amplificazione rispetto ad altri metodi possono essere necessarie per raggiungere densità ottimale di semina.
Alcuni campioni di cancro sono particolarmente difficili da sequenziare a causa di inibitori che persistono dopo l'isolamento del DNA. Per identificare questi campioni prima della preparazione biblioteca, il saggio qPCR QC rileva anche l'inibizione di amplificazione includendo un modello esogeno che serve sia come controllo interno e una sentinella per l'inibizione funzionale. Un esempio è illustrato nella Figura 3, in cui un campione di DNA melanoma riuscito a passare l'inibizione QC metrica prima sequenza e poi riuscito a generare una libreria che potrebbe essere sequenziato. Il fallimento era probabilmente una conseguenza della contaminazione melanina, un inibitore della PCR nota, derivanti dal passaggio isolamento FFPE DNA. I campioni che sono identificati con il test di controllo di qualità per essere a rischio di insufficienza di amplificazione può essere recuperato attraverso un ulteriore passaggio t clean-upo eliminare potenziali inibitori.
Il pannello 21-genica mirata concentra su hotspot gene evidence-based e fornisce un sistema completo di reagenti ottimizzati e controlli per il DNA di controllo di qualità, NGS e la bioinformatica un software che è informato da risultati di quantificazione del DNA "funzionali" pre-analitiche. Il metodo rileva con precisione le mutazioni di base di sostituzione e indels dal DNA a basso input e fornisce un esempio di un sistema di NGS con la possibilità di espandere il contenuto del pannello, per rilevare le varianti aggiuntive come CNVs ed essere adattato per il sequenziamento di RNA mirato.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Annette Schlageter per la revisione del manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da sovvenzioni CP120017 dalla prevenzione del cancro e Research Institute del Texas (PI: GJL).
Materials
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| AIL001 – AIL048 (48) | |||
| Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| AIL049 – AIL096(48) | |||
| 2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
Riferimenti
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