낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱
Summary
An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.
Abstract
모든 차세대 시퀀싱 (NGS) 절차는 생물 정보학 파이프 라인 ( "건조 벤치")를 사용하여 수행 분석 ( "젖은 벤치")와 데이터를 실험실 벤치에서 수행 분석을 포함한다. 이 두 요소는 임상 실험실에 특히 중요 정확하고 신뢰할 수있는 결과를 생산하는 것이 필수적이다. 대상 NGS 기술은 점점 사전 정밀 의학 목표를 도와 종양학 응용 프로그램에서 은혜를 발견, 아직 방법은 자주 끊어과 습식 및 건식 벤치 워크 플로우 및 조정되지 않은 시약 세트 변수를 포함한다. 이보고에서는, 서열이 광범위한 표적 NGS 시스템의 일례로서 21 유전자 패널 암 시료를 도전하기위한 방법을 설명한다. 이 시스템은 독립형 생물 정보학 제품군과 분석적 검증, 단일 소스 시약을 사용하여 기능 DNA 정량 및 자격, 단일 튜브 멀티 플렉스 PCR 농축 및 라이브러리 정화 및 정상화를 통합합니다.그 결과, 정확한 변형에서 통화 품질이 낮은 저 량 포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 및 미세 침 흡인 (FNA) 종양 생검을 달성 할 수있다. 상기 방법은 통상적으로 400 증폭 DNA 카피의 입력에서 암 – 관련 변형을 평가할 수 있고, 새로운 유전자 콘텐츠를 수용하는 모듈 식으로 설계이다. 분석적으로 정의 컨트롤의 두 가지 종류가 임상 적으로 관련 샘플 품질 보증 및 도움 보전과 전화 정확도를 제공한다. 유연한 "태그"PCR 단계는 일반적으로 벤치 탑 NGS 장비 샘플 바코드와의 호환성을 할 수 있도록 플랫폼 별 어댑터와 인덱스 코드를 포함합니다. 중요한 것은,이 프로토콜은 유선형이며, 하루에 24 서열 준비 라이브러리를 생산할 수있다. 마지막으로, 방법은 돌연변이 검출 정밀도를 향상시키고 위음성 및 indeterm 차별화 알고리즘을 호출 변형에 직접 미리 분석 샘플의 품질 관리 결과를 통합하여 건식 및 습식 벤치 처리 링크가하는 통화. 이 타겟 NGS 방법은 그리고 wetware 높은 깊이 다중화 시퀀싱 및 진단 애플리케이션 이종 암 샘플 민감한 분석을 달성하기 위해 소프트웨어 모두의 진보를 이용한다.
Introduction
정밀 의학은 환자에 대한 진단 및 치료 옵션의 개별화에 의존한다. 맞춤형 치료의 약속은 분자 진단 및 표적 치료제의 링크를 알릴 수 질병 경로의 개선 된 이해의 직접적인 결과이다. 예를 들어, 분자 표적 치료의 사용을 2013 년 1 2003 년 46 %로 11 % 증가하고, vemurafenib 및 crizotinib와 같은 항암 약물 동반자 진단 테스트와 FDA-삭제됩니다. 정확하게 매우 다중화 된 샘플 세트를 통해 미량 시퀀스 타겟을 복구하는 능력과 함께, 차세대 시퀀싱 (NGS)는 암과 관련된 유전자의 수차를 평가하는 정밀 의학 분자 표적을 식별하기위한 선택의 방법으로 떠오르고있다.
분자 테스트를위한 가장 일반적인 고체 종양 생검은 포르말린 고정 포함, 파라핀 (FFPE) 및 미세 침 흡인 (FNA) specimENS. 이 샘플은 낮은 수량 및 / 또는 낮은 품질의 정확한 NGS는 2-5 발생 평가에 도전 핵산을 내포한다. 이들 시료의 분석을위한 현재 상업적 NGS 방법은 다른 시약, 프로토콜, 지속적인 개선의 움직이는 대상을 나타내는 정보학 도구의 패치 워크에 기초한다. 예를 들어, 분석 화학 및 / 또는 소프트웨어의 변경은 가장 일반적으로 사용되는 타겟 NGS 키트 6 매 1-2개월 일어났다. 이 불안정성 구성 특히 암 테스트 도전 표본 유형 통일 NGS 시스템 확인의 일관성 결여를 반영하고, 시료 대 결과에서 최적화 응집 프로토콜을 개발 실험실에 과도한 부담을 둔다. 사실, NGS의 사용자 중 한 최근 조사에 설립, 의료 – 실행 가능한 내용, 확고한 생물 정보학 전문 지식을하는 solidifi에 대한 요구 사항과 함께,이 "빠르게 변화하는"기술의 어려움을 강조온 – 더 – 직업 훈련 (7) 촉진 에드 빠르게 구현 될 수 통합 절차 및 간소화 된 워크 플로우를 간소화 프로토콜. 이 기사에서는 대상 NGS를위한 포괄적 인 시스템은 이러한 격차를 해결하는 기술되어있다.
제시된 방법은 임상 적으로 관련 암 유전자 좌위의 NGS 할 대상 정량 검출 정밀도, 감도, 및 신뢰성을 향상시키기 위해 건식 및 습식 모두 벤치에서 사전 분석에 게시 및 분석 모든 절차 단계를 통합한다. 이 방법은 DNA의 품질을 평가하는 매우 낮은 템플릿 복사 심문에서 발생할 수 위양성 호출에 대해 PCR 농축 단계에 입력하고, 가드 안내 "기능"DNA (4)의 정량화로 시작한다. 단일 튜브 멀티 플렉스 PCR은 NGS의 날기위한 플랫폼 별 서열의 혼입 한 후, 400 증폭 DNA 복사본을 사용하여 46 궤적 (21)의 암 유전자에 대한 풍부g 공통 데스크탑 시퀀싱 장비. 라이브러리는 단순 마그네틱 비드 절차를 사용하여 정제하고, 신규 교정없이 qPCR을 분석하여 정량화한다. 통화 성능을 향상시키기 위해 샘플 DNA의 품질 관리 결과에 의해 통보 독립 생물 정보학 스위트 룸, NGS 다음 서열 분석을 제공합니다. 우리는 염기 치환 돌연변이, 삽입 / 결실 (삽입과 삭제를) 공개 대상 NGS이 시스템 접근 방식을 사용하여 데이터를 표시하고, 숫자는 FFPE와 FNA 샘플 및 실행 낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검에서 (CNVs)를 변형 복사 통제 수단.
Protocol
Representative Results
Discussion
NGS 기술은 임상 9 종양 생검의 분자 프로파일을 심문에 대한 기대를 재정의했다. 타겟 NGS 패널 수많은 임상 검체 3,5,10-15 복수 종류의 평가를위한 조사 기술 개발 실험실 검사 및 시판품 맞춤 패널로서 개발되어왔다. 여러 연구 보고서는 게놈 변경 3,10-12,14의 검출을위한 민감하고 특정 임상 도구로 NGS의 가치를 증명하고있다. 그러나 연구는 또한 FFPE는 2-5,12,14을 표본으로 도전 암 조직 검사에서 위양성 결과가 발생할 수 있습니다 유물의 위험을 증명하고있다. 또한, 최근 출판물은 낮은 입력 DNA (12)의 사용에 의해 악화되는 상업 대상 NGS의 패널 (16)과 거짓 양성 호출 종양학를 사용하여 NGS 높은 실패율을 표본 강조했다. 따라서 일부 LABORA토리 중 하나를 수정하거나 상업적으로 이용 가능한 대상 NGS 기술은 정확성을 보장하거나 생물 정보학은 5,10,11 분석에서 결과를 확인하기 위해 자주 성능을 향상시키기 위해 추가 견제와 균형을 추가했습니다.
21 유전자 패널 (그림 2)와 같은 FFPE 및 FNA 종양 생검 등의 도전 시편 종류의 증거를 기반으로 실행 가능한 돌연변이를 심문 할 수있는 포괄적 인 NGS 시스템에 대한 대상 콘텐츠로 개발되었다. 워크 플로우는 이점이있다 : 균일 앰플 리콘에 따르면 (도 3 및 4, 표 3)를 설치함으로써 1) 일관성; 2) 사용 용이성을 제공하여, 최적화 된 시약 세트를 미리 배합하고, 생물 정보학 요건을 단순화; 워크 플로우를 간소화 및 다른 상업적인 NGS 방법에 비해 피펫 공정 수를 줄여 3) 효율; 않는 앰프를 평가하기위한 QC DNA 분석을 포함하여, 4) 정확도수 DNA 복사 번호는 허용 템플릿 다양성을 보장하고 변형 감지 4의 확률 적 변동을 방지 할 수 있습니다. 생물 정보학 분석과 사전 분석 QC 데이터의 통합은 FFPE DNA의 낮은 입력이 가능합니다. 이는 진실 독립적 대책 400 FFPE 시료 전체 DNA 입력 상이한 기능 사본을 사용하여 결정 트리 알고리즘을 훈련 및 생물 정보학 소프트웨어에 이러한 알고리즘을 통합함으로써 달성되었다. 따라서, DNA의 FFPE ~ 5-20 NG 전형적 당량 400 증폭 카피 권장 입력은 FFPE DNA의 250 ~ 17,18 NG가 추천 혼성화 기반 농축을 포함하는 다른 방법 10-12 버금가 . 기술이 MiSeq 플랫폼의 사용에 대해 기재되어 있지만, 다른 NGS 플랫폼 서열 분석을 사용하는 기기 별 태그 어댑터 PCR 프라이머를 사용하여 변형 될 수있다.
몇 가지 단계가 성공을 보장하는 것이 중요하다절차. 사전 분석 QC 분석은 DNA 및 보고서 기능 억제의 증폭 카피 수를 결정합니다. 400 미만 증폭 DNA 카피는 PCR 농축 공정에서 사용되는 경우, 미량 돌연변이 샘플에서 위음성 호출 (도 6)의 증가 된 위험이있다. 또한, 치료는 세척 또는 용출 단계에서 자기 구슬을 통해 건조를 방지하기 위해 라이브러리를 정제하는 동안주의해야합니다. 또한, 성공적인 라이브러리 정량화 라이브러리 DNA의 정확한 희석에 크게 의존한다. 최상의 결과를 들어, qPCR에의 차이는 ≤3.3 Cq와해야 샘플 라이브러리 LQ 표준 (Cq와 VIC)에 비해 (된 CQ FAM)에 대해 발생합니다. 그 차이가 3.3 이상 Cq와 재 희석 및 샘플 시험 인 경우에 권장된다. 우수한 상관이 경쟁 qPCR의 방법과 상업용 키트 사이 관찰되었지만, 표준 곡선을 사용하여 절대 정량을 제공하는다른 방법으로 클론의 증폭 단계에 대해 라이브러리의 입력 오프셋 최적 파종 밀도를 달성 할 필요가있다.
일부 암 표본 특히 때문에 DNA 분리 후 지속 억제제의 시퀀스에 도전한다. 라이브러리 준비하기 전에 이러한 샘플을 확인하기 위해, qPCR에 QC 분석은 또한 내부 통제 및 기능 억제를위한 감시 두 역할을하는 외생 템플릿을 포함하여 증폭 억제를 감지합니다. 예는 흑색 종의 DNA 샘플 메트릭 전에 순서에 QC 억제를 통과하는 데 실패하고 염기 서열을 할 수있는 라이브러리를 생성하는 데 실패하는 그림 3에 제시되어있다. 실패 가능성이 FFPE DNA 분리 단계 이월 멜라닌 오염 공지 된 PCR 억제제의 결과였다. 품질 관리 분석에 의해 식별되는 샘플은 별도의 청소 단계 t를 통해 회수 할 수있다 증폭 실패에 대한 위험에 노출 될 수 있습니다오 잠재적 억제제를 제거합니다.
대상 21 유전자 패널은 증거 기반 유전자 핫스팟에 초점을 맞추고 DNA QC, 사전 분석 "기능"DNA 정량 결과에 의해 통보 NGS 및 생물 정보학 소프트웨어에 최적화 된 시약 및 컨트롤 완벽한 시스템을 제공한다. 상기 방법은 정확한 저 입력 DNA의 염기 – 치환 돌연변이 삽입과 삭제를 검출하고, 이러한 CNVs 같은 추가적인 변형을 검출하고, 표적 RNA 서열에 대해 적응 될, 패널의 콘텐츠를 확대하기 위해 옵션으로 NGS 시스템의 일례를 제공한다.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 원고의 검토를 위해 박사 아네트 Schlageter 감사합니다. 이 작품은 암 예방과 텍사스 연구소 (: GJL PI)에서 부여 CP120017에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 | |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 | |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| Diluent | Asuragen | 145339 | |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 | |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 | |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 | |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 | |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 | |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 | |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ Master Mix | Asuragen | 145358 | |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 | |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 | |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 | |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| Index Codes (ILMN) – Set A, AIL001 – AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| AIL001 – AIL048 (48) | |||
| Index Codes (ILMN) – Set B, AIL049 – AIL096(48) | Asuragen | 150005 | |
| AIL049 – AIL096(48) | |||
| 2X Index Master Mix | Asuragen | 145361 | |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 | |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 | |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 | |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| Magnetic Stand-96 (Or equivalent device) | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
Riferimenti
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