ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

注：このプロトコルは、MiSeq NGSシステムを使用して、サンプルの同時処理が記載されているが、個人ゲノムマシン（PGM）の機器に適合させることができます。 400増幅テンプレートコピーの推奨最小DNA入力の場合、アッセイは318チップにPGMを使用して、24のサンプルについてNGSランあたり96サンプルのそれぞれについて、少なくとも3,000x中央値カバレッジ、および同等のカバレッジの深さを生成することができます。この方法は、リアルタイムPCR機器を使用する必要があります。 1. DNA機能の定量化及び品質管理（QC） 雪解けの試薬：2×マスターミックス、プライマープローブミックス、阻害プライマープローブミックス、6-カルボキシ-X-ローダミン（ROX）、希釈剤、および4つのヒトゲノムDNAの検量線標準（DNA標準（50 ngの/μl）を、DNAスタンダード（10 ngの/μl）を、DNAスタンダード（2 ngの/μL）、およびDNAスタンダード（0.4 ngの/μL））（ 表1）。 10秒間最大速度で10秒間遠心のための全ての試薬は、コンテンツを収集するための渦。氷上で2×マスターミックスをしてください。 試験されるサンプルの総数のためのマスターミックスを十分に準備し、ピペッティングによる不足を回避するために、10％より多くの量が含まれます。サンプルごとに、次のボリュームを使用して、マイクロチューブ内のマスターミックスを調製する：5μlの2×マスターミックス、0.5μlのプライマープローブミックス、0.5μlの阻害プライマープローブミックス、0.05μlのROX及び2.95μlの希釈液。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心のための渦。 96ウェルプレートのウェルに9μlのマスターミックスを加えます。 検量線を作成するために二重にDNA規格の1μLを加えます。アップダウンを5回ピペッティングして混ぜます。 核酸試料は、使用前に十分に混合であることを確認してください。マスターミックスに1μlのサンプルを追加し、上下を5回ピペッティングして混ぜます。 コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心分離用プレート、渦をシール。 PCRシステムにプレートを置きます。 FAM（機能的定量化）およびVIC（機能阻害）を製造者の指示に従って、各サンプル用の検出器の両方を割り当てます。 95℃で10分間のPCRサイクルを実行し、（95℃、60℃で1分、15秒）を40サイクル。 ソフトウェア・プロトコルを使用して、重複するDNA標準の各々についての線形回帰プロットを生成することによって定量PCRデータを分析します。 x軸とy軸上の対応するFAM CのQ値の各DNAを、標準のコピー数のログ10をプロットします 。 DNA標準検量線のダイナミックレンジ内の核酸試料の秋からの結果ことを確認し、参照標準曲線上の対応する位置から1μl当たり「機能」または増幅コピー数の未知のDNAの濃度を計算します。 図1は、渡された、失敗した検量線の例を示します。</李> 増幅はVICチャネルにおける非ヒト標的アンプリコンの存在を確認することにより、各反応で発生したかどうかを確認します。 注：ポジティブコントロールとして、阻害プライマープローブミックスは、非ヒト外因性標的および対応するテンプレートに特異的なプライマーが含まれています。阻害プライマープローブミックスは、無鋳型対照（NTC）を含めて、各反応に添加されたマスターミックスの成分です。阻害剤の非存在下では、非ヒト対象のためのPCR産物は、常に、VICチャネルで検出されるべきです。 VICチャネル内の試料のための「未検出」C qはさらなる処理の前に、試料の後続のクリーンアップから利益を得ることができるPCR阻害剤の存在を示します。 2.ライブラリの準備：遺伝子特異的（GS）PCR pipettによる不足を回避するために試験されるサンプルの総数のためのマスターミックスの十分な量を調製し、10％以上の体積を含みる。サンプルごとに、次のボリュームを使用して、マイクロチューブ内のGS PCRマスターミックスを調製する：5μlの2倍増幅マスターミックス（ 表1）と1μlのパンがんプライマーパネル（ 表1）。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心のためのアップダウン、渦をピペットで混ぜます。 96ウェルプレートのウェルに6μlのGS PCRマスターミックスを分注し。個々のウェルに各核酸サンプルの4μlを添加します。他のウェルに、FFPEコントロール4μlの（ 表1）、マルチバリアント・コントロール（ 表1）の4μlの、および手続きNTCのためのヌクレアーゼフリー水4μlを添加します。各添加のために、アップダウンを5回ピペッティングして混ぜます。 コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心分離用プレート、渦をシール。 以下のPCRサイクルのためのサーマルサイクラーでプレートを置き：95℃で5分間、2サイクル（95℃で15秒、60℃で4分）、23サイクル（95℃、72℃、4分で15秒）、72℃で10分間の最終伸長。 4℃で保持します。 注：ステップ2.4​​が完了した後、プレートをGS PCRプレートと呼ぶことにします。 3.ライブラリの準備：タグPCR 雪解けの試薬 ​​：2倍指数マスターミックス（ 表1）とインデックスコード（ 表1）。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心のための渦。 注：インデックスコードは、各サンプルについてのペアワイズ指数（バーコード）の固有のセットを提供するために予混合されます。 -とダウン最大5回を96ウェルプレートで、よく指定に2倍のインデックスマスターミックスの7.5μlのとインデックスコードの5.5μlを添加し、ピペッティングにより混合します。 慎重GS PCRプレートを開き、マスターミックスを使用して新しいプレートに2μLGS PCR産物を追加します。アップダウンを5回ピペッティングで。各サンプルについて、サンプルIDと対応するペアごとのインデックスコードを記録します。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心分離用プレート、渦をシール。 10サイクル（95℃、55℃、72℃で1分、30秒で30秒）、及び72で10分間の最終伸長、95℃で5分間、サーモサイクラーおよびPCRにプレートを置き°C。 4℃で保持します。 注：ステップ3.4が完了した後、プレートをタグPCRプレートと呼ぶことにします。 4.図書館精製およびサイズ​​の選択 2-8°Cからライブラリピュア準備磁気ビーズ（ 表1）および溶出緩衝液（ 表1）を取り外し、30分間室温に平衡化することができます。洗浄緩衝液（ 表1）容器、キャップに9.6ミリリットルの100％エタノールを加え、ボトルを数回転倒混和します。 10秒のための磁気ビーズをボルテックスし、9の別々のウェルに11μLを追加6ウェルプレート。 タグPCRプレートを開き、ビーズやピペットミックスに5回タグPCR産物の10μlを添加します。 RTで4分間混合物をインキュベートします。 4分間磁気スタンド（ 表1）に、96ウェルプレートを置きます。まだスタンドに96ウェルプレートで、ピペットで上清を除去し、廃棄します。 -とダウン最大5回を磁気スタンドから96ウェルプレートを取り外し、各ウェルに100μlのエタノール含有洗浄緩衝液を添加し、ピペッティングにより混合します。 2分間インキュベートします。 ピペットで上清を除去し、廃棄した後、2分間磁気スタンドに96ウェルプレートを置きます。 第二洗浄した後、可能な限り多くの洗浄液を除去する2エタノール洗浄の合計を繰り返しステップ4.5、、。 磁気スタンド上で96ウェルプレートを使用すると、その後、室温で2分間ビーズを乾燥スタンドからプレートを取り外します。 各WELに20μlの溶出バッファーを添加することにより、ビーズを再懸濁リットルとピペット5回-とダウンアップ。 室温で2分間インキュベートします。 4分間の磁気スタンドに戻って96ウェルプレートを置き、慎重に新しいウェルに透明な上清の18μLを削除して転送します。 注：手順は安全-15 -30℃で保存し、このステップサンプルで停止することができます。再起動するには、先に進む前に、氷上で凍結サンプルを解凍。 5.図書館定量解凍ライブラリクワント（LQ）の試薬 ​​：2倍LQマスターミックス、LQプライマー/プローブミックス、LQスタンダードLQポジティブコントロール、LQ希釈液、およびLQ ROX（ 表1）。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心のための渦。 精製されたライブラリ製品を使用して、LQ希釈剤の個々のサンプルの連続希釈を行います。 198μlのLQ希釈液に2μlの（ライブラリ精製物）を追加し、アップダウンピペットで10回を混ぜます。 1：（100希釈1）2μLを追加98μlのLQ希釈液とは、ピペット10倍で上下を混ぜます。 試験されるサンプルの総数のためのLQマスターミックスを十分に準備し、ピペッティングによる不足を回避するために、10％より多くの量が含まれます。サンプルごとに、次のボリュームを使用して、マイクロチューブ内LQマスターミックスを準備：5μlの2X LQマスターミックス、2μlのLQプライマー/プローブミックス、0.5μlのLQ標準と0.5μlのLQ ROX。コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心のためのアップダウン、渦をピペットで混ぜます。 光学96ウェルプレートのウェルに8μlのLQマスターミックスを追加します。 別々のウェルでは、2μlの希釈されたライブラリー、2μlのLQ陽性コントロールと2μlのLQの希釈液（NTC）を追加し、-とダウン最大5回ピペッティングして混ぜます。内容物を収集するために10秒間400×gで10秒間遠心分離するための光学接着フィルム、ボルテックスでプレートを密封します。 FAMとVIC detectoの両方を割り当て各サンプルのRS。 95℃で5分間のサイクル条件を用いてPCR増幅を行い、（95°C、60°Cで1分、15秒）を40サイクル。 比較C qを法を用いて、各サンプル（NM）の濃度を決定します。未知のライブラリ（C Qが FAM）に知られLQ標準（C qをVIC）の違いを計算します。希釈したサンプル（PM）の濃度は、以下の式を用いて計算されます。 [ コンクlibに ] nMで = 12.5×2Δ はCq 万以外の希釈係数を使用している場合は、10,000の目標希釈率の比を計算し、5.7での式の結果によって、この係数を掛けます。 6.図書館正規化とサンプル・プーリングプールされるべきすべてのサンプル（それぞれが固有のペアごとのインデックスを含む）全体の中央値濃度（nM）を決定します。 個々の試料volumを決定E（μl）を、その個々の濃度（nM）をで割るその後、5によってすべてのサンプル全体の中央値濃度を乗じてプールに。最も近い整数に結果の値ラウンド。ラウンドの値を持つボリューム<2μLに2μlを、およびボリューム> 15μlを15μlの。 サンプルプールを作成するために、単一のマイクロチューブに各サンプルの正規化されたボリューム（μl）を追加します。 丸められた整数値を使用して、各サンプルについての新しい濃度​​を計算し、結果を記録します。 サンプルプールの濃度を決定するために、すべての個々の濃度の合計を計算し、その結果の値（nM）を記録します。 シーケンシング希釈液（ 表1）を用いて、1.25 nMのにサンプルプールを希釈します。 注：手順は安全-15 -30℃で保存し、このステップサンプルで停止することができます。再起動するには、先に進む前に、氷上で凍結サンプルを解凍。 7.シーケンシング DenatURE以下を追加してPHIXコントロールv3の（ 表1）の存在下でのサンプルプール：1.25 nMのサンプルプール15μlの、0.5 nMのPHIXの3μlを1 N NaOHを2μLを。渦が簡単に短時間遠心分離し、室温で5分間インキュベートします。 氷上で変性したサンプルプールを配置します。 マイクロチューブにあらかじめ冷却HT1-hyb緩衝液の992μlに変性したライブラリーの8μlを添加します。ボルテックスは簡潔に内容を収集するために、短時間の遠心分離に続いて、混合します。氷の上に保管してください。 試薬カートリッジの＃17を配置するために変性し、希釈したライブラリーの600μLを加えます。 解凍読む1シーケンシングプライマー（ 表1）、インデックス読むシーケンシングプライマー（ 表1）、および読み取り2シーケンシングプライマー（ 表1）。マイクロ遠心チューブでは、別々に636μlのHT1-hyb緩衝液で4μlの配列決定プライマーを希釈。注：HT1-hyb緩衝液は、ウィットに提供されH配列決定試薬キット（ 表1）。 コンテンツを収集するために10秒間最大速度で10秒間遠心ボルテックスにより混合します。シーケンシング試薬カートリッジの＃18を位置決めするための希釈読む1の配列決定プライマーの600μlを添加し、希釈したインデックスを読むプライマー600μlのは＃20を配置するために＃19、および希釈読む2配列決定プライマーの600μLを位置決めします。 製造元の指示に従ってNGS機器（ 表1）および配列上の試薬 ​​をロードします。ペアエンド2×150サイクルシークエンスランを実行します。 8.データ解析注：NGS機器・ソフトウェアは、ベースコールと品質スコアにクラスタの画像を変換し、各サンプルの個々のgzipで圧縮FASTQ（* .fastq.gz）ファイルを生成するために、ペアごとのインデックスを分離します。逆多重化されたファイルを分析する前に、読者は、 表 （関連するバイオインフォマティクスソフトウェアをダウンロードし、インストールする必要があります1）。ソフトウェアは、消費者向けのWindows PCにインストールすることができ、データ分析を実行するために特化したコンピューティングハードウェアまたはインターネット接続を必要としません。 ソフトウェアのデスクトップアイコンをダブルクリックします。 ソフトウェアのマニュアルに提供されたユーザ名とパスワードを使用してシステムにログインします。 プロジェクトダッシュボードを開き、「新規プロジェクト」をクリックします。 プロジェクトに名前を付け、任意のプロジェクトの説明を提供します。対象とNGSパネルの種類とNGS機器の種類を選択します。 「保存して続行」をクリックします。 前進用の圧縮FASTQファイルをアップロードし、読み込み逆。それが逆多重化に失敗した読み込み含まれ、「未割り当て」FASTQsを、アップロードしないでください。 「保存して続行」をクリックします。 インプットDNAの機能的定量アッセイによって決定される各ライブラリーを調製するために使用される機能的な入力コピー数（上記のステップ1を参照）。手動でスプレッドから値またはコピー＆ペーストの値を追加します注釈テーブルにシート。 「保存して続行 "をクリックします。 分析のためにアップロードされた注釈付きのライブラリを確認し、分析を開始するには、「分析を送信」をクリックします。 プロジェクトダッシュボードで表示された分析の進行状況を監視します。 注：結果はレビューのために準備ができているとき、分析、完全な状態表示が提示されます。 ライブラリーあたりの総カバレッジを含むサンプルのQCメトリックの分析結果を確認し、の割合は、フィルタを通過し、アンプリコンのカバレッジの深さと均一性を読み込みます。 dbSNP、COSMIC、千ゲノムおよび機能と人口レベルの注釈の他のソースと、各配列を決定し、ライブラリのバリアントの呼び出しを確認します。 補完的なインフォマティクスツールとの長期保存や下流の分析のためのサマリー表計算表、* .bamファイルと*の.vcfファイルとして生の結果をエクスポートします。