Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
El objetivo general de este método es medir con exactitud la tasa glucolítica de células por medio de análisis de flujo extracelular. La medición cuantitativa de la tasa glucolítica utilizando acidificación extracelular es el punto final deseado de muchos experimentos. Sin embargo, la tasa total de la acidificación extracelular es la suma de dos componentes: la acidificación respiratoria, en forma de CO 2 (que hidrata a H 2 CO 3 y luego se disocia de HCO 3 – + H +), y la acidificación glicolítica, en forma de lactato – + H +.
Las contribuciones de CO 2 a la acidificación extracelular total de hasta hace poco han sido considerados insignificantes en la plataforma de medición utilizado aquí, el analizador XF24 7. Sin embargo, es evidente en otros múltiples sistemas que el CO2 puede ser un importante contribuyente a 04.05 acidificación extracelular. Múltiples documentos reconocen esta estafacontribución, pero no intente cuantificación directa de CO 2 -derivado 3,8,9 ácido. Recientemente hemos demostrado cuantitativamente que la producción de CO2 es una fuente importante de acidificación extracelular en este sistema 6. Por otra parte, aunque hay múltiples vías metabólicas que generan CO 2 del catabolismo de la glucosa, las realizadas por deshidrogenasas matriz en el ciclo del ácido cítrico son los contribuyentes abrumadoras y todas las demás fuentes generan cantidades de CO 2 que se encuentran dentro del error experimental 6.
Sin la corrección de producción de CO 2, la acidificación extracelular, por tanto, es un indicador de la tasa de ambigua glucolítica y no se puede utilizar cuantitativamente. Nuestra publicación anterior pone de manifiesto varios casos en que respiratoria CO 2 comprende la mayor parte de la señal total acidificación, incluso en las células en general se cree que utilizar principalmente la glucólisis 6. Además, elrespiratoria CO 2 contribución a la acidificación total varía ampliamente durante el curso de los experimentos de perfiles metabólicos comunes, lo que demuestra que la correcta comparación de la tasa glucolítica durante las diferentes partes de un experimento requiere corrección para el CO 2.
Para medir la tasa glucolítica de células por medio de la tasa de acidificación extracelular, es necesario convertir los cambios de pH a los cambios en total H + generados, y para restar la acidificación extracelular causada por CO 2 liberado durante el funcionamiento del ciclo del ácido cítrico. Aquí se describe un método sencillo para medir la tasa de producción de protones extracelular (de cambios extracelulares en el pH y la potencia calibrada tampón del medio de ensayo) y la producción de CO 2 (a partir de los cambios extracelulares en O 2 concentración), y demostrar cómo calcular la tasa glucolítica el uso de estas mediciones.
Esta fortaleza método ens la utilidad de la medición de la acidificación extracelular, al usarla para calcular correctamente tasa glicolítica tal como se define por la producción de lactato. Sin corrección para CO respiratoria 2 (o la medición directa de lactato), es imposible para determinar si y en qué medida la tasa total de la acidificación refleja tasa glucolítica, confundiendo la interpretación de los experimentos que utilizan la acidificación extracelular total como medida directa de la producción de lactato.
CÁLCULOS
CO 2 y el lactato son, dentro del error experimental, los dos únicos contribuyentes a la producción de ácido extracelular, basados en experimentos con células de mioblastos 6. Por lo tanto, la tasa de acidificación extracelular total de (PPR, la tasa de producción de protones) se puede definir como:
PPR tot = PPR resp + PPR Glyc Ecuación 1
. _content "> donde tot = total, resp = respiratoria; Glyc = glucolítica glicolítica PPR es así:PPR Glyc = PPR tot – PPR resp Ecuación 2
Aquí,
PPR tot = ECAR tot / BP Ecuación 3
donde ECAR = tasa de acidificación extracelular (mph / min), y BP = poder tampón (mph / pmol H + en 7 l), mientras que
PPR resp = (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1)) (máx H + / S 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ecuación 4
donde K 1 = constante de equilibrio combinado de CO 2 de hidratación y la disociación de HCO 3 – + H +; max H + / S 2 = XXe CO 2 acidificación -derivado de una transformación metabólica particular, tales como la oxidación completa de la glucosa 6; OCR = tasa de consumo de oxígeno (O 2 pmol / min), y OCR rot / myx = no mitocondrial OCR.
Ecuación 4 aísla mitocondrial OCR restando cualquier OCR no mitocondrial (definido como OCR que es resistente a los venenos respiratoria rotenona y myxothiazol mitocondrial) y representa el máximo de H + generado por O 2 consumido para cada sustrato (max H + / O 2 ) (ver 6), así como la proporción de CO 2 dando lugar a H + a la temperatura experimental y pH (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1). Para la oxidación completa de la glucosa, oxígeno mitocondrial Consumo Rate (OCR) es exactamente igual a la tasa de producción de CO 2. En el volumen de ensayo confinados de la medición de flujo extracelular, CO 2 productosd por la respiración permanece atrapado en el medio de ensayo. La mayoría de los atrapados CO 2 se hidrata a H 2 CO 3, que luego se disocia de HCO 3 – + H +. Una pequeña fracción permanece disuelto pero no hidratada, y otra pequeña fracción es hidratado pero no disociado, según lo dictado termodinámicamente por la constante de equilibrio combinado de CO 2 hidratación y la disociación de HCO 3 – + H + a temperatura experimental (37 ° C) y pH (~ 7,4).
Por lo tanto, la ecuación completa para el cálculo de PPR g restando PPR resp del PPR tot es:
PPR Glyc = ECAR tot / BP – (10 pH-pK 1 / (1 + 10 pH-pK 1)) (máx H + / S 2) (OCR tot – OCR rot / myx) Ecuación 5
yon esta manera, las tasas de respiración y la glucolisis, así como sus tasas de producción de ATP asociados, puede determinarse cuantitativamente a partir de mediciones directas (consumo de oxígeno, la acidificación extracelular, capacidad de tamponamiento) y la importación o el cálculo de otros valores requeridos (H + E / S 2 , P / O, y el equilibrio constante K 1) 6. El experimento descrito aquí se expande sobre las técnicas estándar para usar el extracelular Flux Analizador como Seahorse XF24 10,11; para otros formatos de medición de flujo extracelular (por ejemplo, XF e 96, o XFP), todos los volúmenes inferiores deben ser escalados apropiadamente.
El poder de tamponamiento del medio de ensayo se puede medir por la construcción de una curva estándar, ya sea directamente en la plataforma de flujo extracelular o por separado usando una sonda de pH calibrado. Aquí, se dan tres opciones para medir buffering por el medio de ensayo de flujo extracelular, incluyendo el uso de todos los injectien los puertos del analizador de flujo extracelular con pocillos de muestras libres de células, o usando sólo el último puerto de inyección en pozos que contiene células (sección 1) o mediante el uso de una medición de pH externo (sección 2). Consulte la hoja de cálculo adjunta para los cálculos completos de datos de ejemplo.
Para medir la potencia utilizando la capacidad amortiguadora del pH de detección del instrumento de flujo extracelular, lo más seguro es utilizar pozos sin células para minimizar la variación de la señal. Sin embargo, dentro del error, no existe diferencia estadística entre libre de células y los pozos cuando se realiza esta medición que contiene células (datos no presentados). NOTA: La variación descrito en la etapa 1.7 lleva la ventaja de dar cuenta de los cambios potenciales para el almacenamiento en búfer conferidos por compuestos añadidos o por la presencia de células, con la desventaja de señal más ruido. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, no se encontraron diferencias significativas en el poder tampón calculada entre el diseño libre de células se muestra en la Tabla 1 yel diseño post-experimento en la Tabla 2, en las condiciones experimentales descritas aquí.
Además, en rangos pequeños ΔpH (<0,4 unidades; experimentalmente mejor restringidas a 0,2 unidades), la pendiente lineal obtiene representando Δ MPH / pmol H + aproxima adecuadamente la relación logarítmica entre ΔpH y [H +]. La pendiente de esta curva estándar por lo tanto, representa el poder tampón del medio de ensayo bajo prueba en pH / nmol H + en 7 l, o mph / pmol H + en 7 l. Se recomienda aumentar el poder de tamponamiento medio o disminución de la densidad celular para las muestras que exceden un cambio unitario 0,2 pH durante el tiempo de medición. El tiempo de medición también se puede disminuir, pero esto puede reducir la tasa de acidificación estado estacionario e introducir error en el cálculo de la tasa.
Acidificación extracelular es una indicación de fácil medición de la tasa metabólica celular. Para determinar correctamente la tasa de glucólisis celular (tal como se define por la producción de lactato) es fundamental para conocer el poder tampón del medio de ensayo, y para convertir las mediciones de flujo extracelulares de consumo de oxígeno y acidificación para protón tasas de producción. Mediante la realización de este cálculo, la acidificación resultante de CO 2 liberado en el ciclo del ácido cítrico se puede restar, dejando la acidificación que resulta de la producción de lactato.
Las múltiples formas diferentes dadas aquí para medir la potencia de amortiguación para esta corrección llevan diferentes ventajas y desventajas. Medición externa utilizando una sonda de pH es muy precisa y reproducible, pero puede no reflejar pequeñas diferencias en la detección de pH introducida por los fluoróforos contenidos dentro de la placa de ensayo, la adición de compuestos durante el ensayo, o la presencia de tél propias células. La mediciones de pH abordan en placa estas cuestiones, pero también introducen diversos grados de ruido experimental.
La corrección CO 2 a ECAR permite por primera vez el cálculo inequívoca y cuantitativa de la tasa de glucolítica, y revela variación de contribución respiratorio y glucolítica a ECAR total durante el curso de un experimento. Utilizando la ecuación 5 y las medidas de OCR, ECAR, y amortiguar la energía, la tasa glucolítica se puede calcular utilizando la simple hoja de cálculo proporcionada (Tabla 6). Esta tasa puede ser verificada mediante la medición de lactato post-hoc si se desea 6. En las células, donde la vía de las pentosas fosfato es altamente activo, el uso de inhibidores de la vía, tales como 6-aminonicotinamida puede ser útil para aislar tasa glucolítica. Cálculo de las contribuciones tanto de CO 2 – y el lactato derivado de H + del total miden extracelular acidificación tarifas y oxígeno Consumption El precio es una herramienta invaluable para el uso de los datos de flujo extracelular hacer declaraciones poderosas y cuantitativos sobre la actividad metabólica.
Usando los procedimientos descritos aquí, incluyendo diversas modificaciones para medir el poder tampón, y optimizando el experimento de flujo extracelular de las células bajo investigación y los datos deseados, la tasa de glucólisis en células intactas se puede cuantificar en una amplia gama de condiciones experimentales. Este método está limitado a células que pueden crecer en cultivo adherente sobre (o células u orgánulos que se puede adherir a) una superficie de poliestireno. Es más fiable cuando las células cultivadas son homogéneos y confluyentes, aunque los datos útiles aún se pueden obtener en un rango de estas condiciones. Los cálculos requieren algún conocimiento del metabolismo de las células, como max + H / O 2 rangos de 0,65 a 1,0 para la oxidación completa de los diferentes sustratos y más para la oxidación parcial 6, sin embargo, si las células son known para oxidar la glucosa, un valor de 1,0 se puede suponer.
Aunque pertinente para todos los caracterización metabólica, este método puede ser particularmente útil cuando se utiliza en sistemas en los que un cambio entre el metabolismo respiratorio y glicolítica para mantener el suministro de ATP celular es un fenotipo crítica, incluyendo la caracterización de las células madre y las células cancerosas derivadas de tumores. La comprensión de las alteraciones de control metabólico en estos y otros contextos permitirá un mayor grado de sofisticación y precisión en el diseño experimental y el análisis de estos tipos de células.
The authors have nothing to disclose.
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
LDH | Sigma | L1254 | chemical |