قياس وتحليل حمض خارج الخلية الإنتاج لتحديد معدل حال السكر
Summary
Glycolysis is a defining metabolic marker in multiple biological systems. Monitoring glycolysis by measuring the extracellular flux of H+ is common, but requires correction to be quantitative and unambiguous. Here, we demonstrate how to gather and correct extracellular flux data to distinguish between respiratory and glycolytic sources of extracellular acidification.
Abstract
Extracellular measurement of oxygen consumption and acid production is a simple and powerful way to monitor rates of respiration and glycolysis1. Both mitochondrial (respiration) and non-mitochondrial (other redox) reactions consume oxygen, but these reactions can be easily distinguished by chemical inhibition of mitochondrial respiration. However, while mitochondrial oxygen consumption is an unambiguous and direct measurement of respiration rate2, the same is not true for extracellular acid production and its relationship to glycolytic rate 3-6. Extracellular acid produced by cells is derived from both lactate, produced by anaerobic glycolysis, and CO2, produced in the citric acid cycle during respiration. For glycolysis, the conversion of glucose to lactate– + H+ and the export of products into the assay medium is the source of glycolytic acidification. For respiration, the export of CO2, hydration to H2CO3 and dissociation to HCO3– + H+ is the source of respiratory acidification. The proportions of glycolytic and respiratory acidification depend on the experimental conditions, including cell type and substrate(s) provided, and can range from nearly 100% glycolytic acidification to nearly 100% respiratory acidification 6. Here, we demonstrate the data collection and calculation methods needed to determine respiratory and glycolytic contributions to total extracellular acidification by whole cells in culture using C2C12 myoblast cells as a model.
Introduction
الهدف العام من هذه الطريقة لقياس دقيق لمعدل حال السكر من الخلايا باستخدام تحليل تدفق خارج الخلية. القياس الكمي للمعدل حال السكر باستخدام تحمض خارج الخلية هو نقطة النهاية المرجوة من العديد من التجارب. ومع ذلك، فإن المعدل الإجمالي للتحمض خارج الخلية هو مجموع عنصرين: تحمض الجهاز التنفسي، في شكل CO 2 (الذي يرطب إلى H 2 CO 3 ثم تنأى لHCO 3 – + H +)، وتحمض حال السكر، في شكل اللاكتات – + H +.
وحتى وقت قريب كانت تعتبر مساهمات CO 2 إلى إجمالي تحمض خارج الخلية تذكر في منصة القياس المستخدمة هنا، محلل XF24 7. ومع ذلك، فمن الواضح في الأنظمة الأخرى المتعددة التي CO 2 يمكن أن تكون مساهما رئيسيا في الخلية تحمض 4-5. أوراق متعددة تقر هذا يخدعtribution، ولكن لا تحاول الكميات مباشرة من CO 2 -derived 3،8،9 الحمضية. أثبتنا مؤخرا كميا أن إنتاج CO 2 هو مصدر هام من مصادر خارج الخلية تحمض في هذا النظام 6. وعلاوة على ذلك، رغم أن هناك العديد من المسارات الأيضية التي تولد CO 2 من هدم الجلوكوز، وتلك التي تقوم بها dehydrogenases مصفوفة في دورة حمض الستريك هي المساهمة ساحق وجميع مصادر أخرى تولد كميات CO 2 التي تقع ضمن الخطأ التجريبي 6.
دون تصحيح لCO 2 الإنتاج، وتحمض خارج الخلية وبالتالي هو مؤشر غامضة من معدل حال السكر، ولا يمكن أن تستخدم كميا. ويبرز لدينا المنشور السابق عدة حالات حيث يضم الجهاز التنفسي CO 2 الجزء الأكبر من إجمالي إشارة تحمض، حتى في خلايا يعتقد عموما لاستخدام أساسا تحلل 6. بالإضافة إلى ذلك،الجهاز التنفسي مساهمة CO 2 إلى إجمالي تحمض تختلف على نطاق واسع خلال التجارب التنميط الأيضية المشتركة، مما يدل على أن المقارنة الصحيحة من معدل حال السكر خلال أجزاء مختلفة من تجربة تتطلب تصحيح CO 2.
لقياس معدل حال السكر من الخلايا باستخدام معدل تحمض خارج الخلية، فمن الضروري تحويل تغيرات درجة الحموضة للتغيرات في إجمالي H + ولدت، وطرح تحمض خارج الخلية التي تسببها CO 2 طرحها أثناء التشغيل من دورة حمض الستريك. هنا، نحن تصف طريقة واضحة لقياس خارج الخلية معدل إنتاج بروتون (من التغيرات خارج الخلية في درجة الحموضة وقوة معايرة التخزين المؤقت للوسط مقايسة) وCO 2 إنتاج (من التغيرات خارج الخلية في O 2 التركيز)، وشرح كيفية حساب معدل حال السكر استخدام هذه القياسات.
هذه القوة طريقة ENS أداة القياس تحمض خارج الخلية عن طريق استخدامه لحساب معدل حال السكر بشكل صحيح كما حددتها إنتاج اللاكتات. دون تصحيح لCO التنفسي 2 (أو القياس المباشر لاكتات)، فإنه من المستحيل تحديد ما إذا كان وإلى أي مدى يعكس معدل تحمض إجمالي معدل حال السكر، يفند تفسير التجارب التي تستخدم الكلي تحمض خارج الخلية كمقياس مباشر من إنتاج اللاكتات.
الحسابات
CO 2 واللاكتات و، داخل الخطأ التجريبي، اثنين فقط من المساهمين في إنتاج حمض خارج الخلية، استنادا إلى التجارب مع الخلايا بالخلايا العضلية الجذعية 6. ولذلك، فإن معدل إجمالي تحمض خارج الخلية (PPR، ومعدل إنتاج بروتون) يمكن تعريفها بأنها:
PPR TOT = PPR التركيب + PPR glyc المعادلة 1
. _content "> حيث TOT = المجموع؛ التركيب = الجهاز التنفسي؛ glyc = حال السكر حال السكر PPR هو على النحو التالي:PPR glyc = PPR طفل – PPR التركيب المعادلة 2
هنا،
PPR TOT = ECAR طفل / BP المعادلة 3
حيث ECAR = معدل خارج الخلية تحمض (ميل / دقيقة)، وBP = طاقة التخزين المؤقت (ميل / بمول H + في 7 ميكرولتر)، في حين
PPR التركيب = (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 + 10 درجة الحموضة PK 1)) (ماكس H + / O 2) (OCR طفل – OCR تعفن / MYX) المعادلة 4
حيث K 1 = المشترك ثابت توازن CO 2 ترطيب والتفكك إلى HCO 3 – + H +. ماكس H + / O 2 = عشرالبريد CO 2 تحمض -derived لتحول التمثيل الغذائي معين مثل أكسدة كاملة من الجلوكوز 6؛ OCR = معدل استهلاك الأكسجين (O 2 بمول / دقيقة)، وOCR تعفن / MYX = غير الميتوكوندريا OCR.
المعادلة 4 يعزل الميتوكوندريا OCR بطرح أي OCR غير الميتوكوندريا (كما هو موضح OCR التي هي مقاومة للالميتوكوندريا التنفسي السموم روتينون وmyxothiazol) ويمثل الحد الأقصى للH + ولدت في O 2 المستهلكة لكل الركيزة (ماكس H + / O 2 ) (انظر 6)، وكذلك نسبة CO 2 مما أدى إلى H + في درجة الحرارة التجريبية ودرجة الحموضة (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 + 10 درجة الحموضة PK 1). لأكسدة كاملة من الجلوكوز، والأكسجين الميتوكوندريا معدل استهلاك (OCR) يساوي بالضبط إلى نسبة CO 2 الإنتاج. وفي حجم فحص يقتصر قياس تدفق خارج الخلية، CO 2 المنتجاتد بواسطة التنفس لا يزال محاصرا في المتوسط الفحص. ورطب معظم المحاصرين CO 2 إلى H 2 CO 3، التي تنأى ثم إلى HCO 3 – + H +. يبقى جزء صغير حل ولكن ليس رطب، وجزء آخر صغير هو رطب ولكن ليس فصلها، وفقا لما تمليه الديناميكا الحرارية التي كتبها ثابت التوازن جنبا إلى جنب من CO 2 ترطيب والتفكك إلى HCO 3 – + H + في درجة حرارة التجريبية (37 ° C) ودرجة الحموضة (~ 7.4).
وبالتالي، فإن المعادلة كاملة لحساب PPR ز بطرح PPR التركيب من PPR طفل هو:
PPR glyc = ECAR طفل / BP – (10 درجة الحموضة PK 1 / (1 + 10 درجة الحموضة PK 1)) (ماكس H + / O 2) (OCR طفل – OCR تعفن / MYX) المعادلة 5
أنان بهذه الطريقة، ومعدلات التنفس وتحلل، وكذلك ترتبط معدلات إنتاج ATP، ويمكن تحديدها كميا من قياسات مباشرة (استهلاك الأوكسجين، وتحمض خارج الخلية، وقدرة التخزين المؤقت) والاستيراد أو حساب القيم الأخرى المطلوبة (H + / O 2 ، P / O، والتوازن K ثابت 1) 6. التجربة الموصوفة هنا تتوسع على التقنيات القياسية لاستخدام التمويه محلل خارج الخلية مثل فرس البحر XF24 10،11. لصيغ قياس تدفق خارج الخلية الأخرى (على سبيل المثال، XF ه 96، أو XFP)، ينبغي تحجيمها كافة وحدات التخزين أدناه بشكل مناسب.
قوة التخزين المؤقت للفحص المتوسطة يمكن أن تقاس بناء منحنى القياسية إما مباشرة في منصة تدفق خارج الخلية أو بشكل منفصل باستخدام مسبار درجة الحموضة معايرة. هنا، يتم إعطاء ثلاثة خيارات لقياس التخزين المؤقت من خارج الخلية تدفق المتوسطة الفحص، بما في ذلك استخدام جميع injectiعلى منافذ للمحلل تدفق خارج الخلية مع عينة الآبار خالية من الخلايا، أو فقط باستخدام آخر ميناء حقن في الآبار التي تحتوي على الخلية (الجزء 1) أو باستخدام قياس درجة الحموضة الخارجي (القسم 2). انظر جدول المرفق للحصول على الحسابات الكاملة للبيانات سبيل المثال.
لقياس قوة التخزين المؤقت باستخدام القدرة على الكشف عن درجة الحموضة الصك تدفق خارج الخلية، فمن الأكثر أمانا لاستخدام الآبار خالية من الخلايا لتقليل التباين إشارة. ومع ذلك، في الخطأ، لا يوجد فرق إحصائي بين (لا تظهر البيانات) والآبار عند تنفيذ هذا القياس التي تحتوي على الخلايا خالية من الخلايا. ملاحظة: الاختلاف هو موضح في الخطوة 1.7 تحمل ميزة يمثل أي تغييرات محتملة على التخزين المؤقت التي يمنحها المركبات المضافة أو بسبب وجود خلايا، مع الحرمان من إشارة ضجيج. لكن، وكما ذكر أعلاه، لا توجد فروق ذات دلالة إحصائية في السلطة التخزين المؤقت المحسوبة بين تصميم خالية من الخلايا هو مبين في الجدول 1 وتصميم بعد تجربة في الجدول 2 تحت ظروف تجريبية موضح هنا.
بالإضافة إلى ذلك، على نطاقات ΔpH الصغيرة (<0.4 وحدة؛ تجريبيا أفضل يقتصر على 0.2 وحدة)، المنحدر الخطي الحصول عليها عن طريق التآمر Δ ميلا في الساعة / بمول H + يقارب نحو كاف علاقة لوغاريتمية بين ΔpH و[H +]. لذا المنحدر من هذا المنحنى القياسي يمثل السلطة التخزين المؤقت من المتوسط فحص تحت الاختبار في درجة الحموضة / نانومول H + في 7 ميكرولتر، أو ميلا في الساعة / بمول H + في 7 ميكرولتر. ونحن نوصي زيادة قوة التخزين المؤقت متوسطة الحجم أو تقليل كثافة الخلايا للعينات التي تتجاوز تغيير وحدة 0.2 درجة الحموضة خلال فترة القياس. ويمكن أيضا أن انخفض قياس الوقت، ولكن هذا قد يقصر من معدل تحمض حالة مستقرة وإدخال خطأ في حساب المعدل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تحمض خارج الخلية هو مؤشر قياس بسهولة من معدل الأيض الخلوي. لتحديد بشكل صحيح معدل تحلل الخلوية (على النحو المحدد إنتاج اللاكتات) فمن الأهمية بمكان أن نعرف قوة التخزين المؤقت للوسط الفحص، وإلى تحويل قياسات التدفق خارج الخلية من استهلاك الأوكسجين وتحمض إلى بروتون معدلات الإنتاج. قبل تنفيذ هذا الحساب، وتحمض الناتجة من CO 2 الذي صدر في دورة حمض الستريك يمكن طرح، وترك تحمض الذي ينجم عن إنتاج اللاكتات.
طرق مختلفة متعددة نظرا هنا لقياس قوة التخزين المؤقت لهذا التصحيح تحمل مزايا وعيوب مختلفة. القياس الخارجي باستخدام مسبار درجة الحموضة ودرجة عالية من الدقة وقابلة للتكرار، ولكن قد لا تعكس الفروق الصغيرة في الكشف عن درجة الحموضة التي أدخلتها fluorophores الواردة في لوحة الفحص، إضافة مركبات خلال الفحص، أو وجود رانه الخلايا نفسها. للفي لوحة قياسات درجة الحموضة وتتناول هذه القضايا، ولكن أيضا إدخال درجات متفاوتة من الضوضاء التجريبية.
تصحيح CO 2 إلى ECAR يسمح لأول مرة على حساب اضح لا لبس فيه والكمي للمعدل حال السكر، ويكشف عن تباين في مساهمة الجهاز التنفسي وحال السكر إلى إجمالي ECAR أثناء التجربة. باستخدام المعادلة (5) وقياسات OCR، ECAR، والتخزين المؤقت السلطة، ومعدل حال السكر يمكن حسابها باستخدام جدول بسيط المقدمة (الجدول 6). يمكن التحقق من هذا المعدل عن طريق قياس اللاكتات اللاحق، إذا رغبت في ذلك 6. في الخلايا حيث مسار الفوسفات البنتوز نشطا للغاية، واستخدام مثبطات ممر مثل 6-aminonicotinamide قد يكون مفيدا لعزل معدل حال السكر. حساب لمساهمات كل من CO 2 – والمستمدة من اللاكتات H + من مجموع قياس الخلوية إضافي تحمض معدل والأكسجين Consumptأيون المعدل هو أداة لا تقدر بثمن لاستخدام البيانات تدفق خارج الخلية في الإدلاء ببيانات قوية وكمية عن النشاط الأيضي.
باستخدام الإجراءات الموضحة هنا، بما في ذلك التعديلات المختلفة لقياس قوة التخزين المؤقت، وتحقيق الاستفادة المثلى من التجربة التدفق خارج الخلية للخلايا قيد التحقيق والبيانات المطلوبة، فإن معدل تحلل في خلايا سليمة يمكن كميا في إطار مجموعة واسعة من الظروف التجريبية. هذا الأسلوب يقتصر على الخلايا التي يمكن أن تنمو في ثقافة ملتصقة على (أو الخلايا أو العضيات التي يمكن الالتزام بها) على سطح البوليسترين. هو الأكثر موثوقية عندما الخلايا المستزرعة هي متجانسة ومتموجة، على الرغم من بيانات مفيدة قد لا يزال الحصول على مجموعة من هذه الشروط. الحسابات تتطلب بعض المعرفة من عملية التمثيل الغذائي للخلايا، والحد الأقصى H + / O 2 نطاقات ،65-1،0 للأكسدة كاملة من ركائز مختلفة وأكثر لالأكسدة الجزئية 6، ولكن إذا كانت الخلايا كnown لأكسدة الجلوكوز، يمكن افتراض قيمة من 1.0.
رغم أهميتها لجميع خصائص الأيض، قد يكون هذا الأسلوب مفيدا بشكل خاص عند استخدامها في النظم التي تحول بين التمثيل الغذائي في الجهاز التنفسي وحال السكر للحفاظ على إمدادات ATP الخلوية هو النمط الظاهري النقدي، بما في ذلك توصيف الخلايا الجذعية والخلايا السرطانية المستمدة من الورم. وفهم التغيرات الأيضية التحكم في هذه وغيرها من السياقات تسمح بدرجة أكبر من التطور والدقة في التصميم والتحليل التجريبي لهذه الأنواع من الخلايا.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank David A. Ferrick and David G. Nicholls for contributing to project conception and presentation, Renata L.S. Goncalves and Akos A. Gerencser for data not shown here and for helpful discussions, Barbara Liepe for XF24 consumables, and Andy Neilson for input in developing Eq. (5).
Materials
| Pherastar FS | BMG | n/a | microplate reader |
| Seahorse XF-24 | Seahorse Bioscience | n/a | extracellular flux instrument |
| Seahorse XF assay plate | Seahorse Bioscience | V7-PS | consumable |
| XF Calibrant | Seahorse Bioscience | 100840-000 | solution |
| HCl standard | Sigma | 38280 | chemical |
| oligomycin | Sigma | O4876 | chemical |
| FCCP | Sigma | C2920 | chemical |
| Rotenone | Sigma | R8875 | chemical |
| Myxothiazol | Sigma | T5580 | chemical |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | medium component |
| FBS | Corning | 35-010-CV | medium component |
| penicillin/streptomycin | Corning | 30-002-CI | medium component |
| carbonic anhydrase | Sigma | C2624 | chemical |
| 96-well assay plate | Corning | CLS3991 | consumable |
| NAD+ | Sigma | N7004 | chemical |
| LDH | Sigma | L1254 | chemical |
Riferimenti
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem. J. 435 (2), 297-312 (2011).
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Anal. Chem. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data. Meth. Enzymol. 547, 309-354 (2014).
- Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol. Biol. Rep. 29 (1-2), 83-87 (2002).
- Helmlinger, G., Sckell, A., Dellian, M., Forbes, N. S., Jain, R. K. Acid production in glycolysis-impaired tumors provides new insights into tumor metabolism. Clin. Cancer Res. 8 (4), 1284-1291 (2002).
- Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. G., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim. Biophys. Acta. 1847, 171-181 (2015).
- Wu, M., et al. Multiparameter metabolic analysis reveals a close link between attenuated mitochondrial bioenergetic function and enhanced glycolysis dependency in human tumor cells. Am. J. Physiol. 292 (1), C125-C136 (2006).
- Nadanaciva, S., et al. Assessment of drug-induced mitochondrial dysfunction via altered cellular respiration and acidification measured in a 96-well platform. J. Bioenerg. Biomembr. 44 (4), 421-437 (2012).
- Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption. Meth. Enzymol. 542, 125-149 (2014).
- Nicholls, D. G., Darley-Usmar, V. M., Wu, M., Jensen, P. B., Rogers, G. W., Ferrick, D. A. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J. Vis. Exp. (46), 2511 (2010).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS ONE. 6 (7), e21746 (2011).
- Seahorse Biosciences. . F24 Extracellular Flux Analyzer and Prep Station Installation and Operation Manual. 1.7, (2010).
- Blau, H., Chiu, C., Webster, C. Cytoplasmic activation of human nuclear genes in human heterocaryons. Cell. 32, 1171-1180 (1983).
