This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Т-лимфоциты являются важнейшими компонентами адаптивной иммунной системы. Т-клетки ответственны за не только непосредственно опосредовании защитные иммунные ответы к патогенам с помощью различных эффекторных механизмов, но и активно поддерживать иммунологическую аутотолерантность и направляя ответы других клеток в иммунной системе. Эти функции направлены через ряд интегрированных сигналов, в том числе Т-клеточного рецептора (TCR) лигирования, цитокинов и хемокинов, и метаболитов 1. Из этих сигналов, TCR имеет особое значение, так как она обеспечивает характерную специфичность, которая определяет роль Т-клеток в адаптивного иммунитета. TCR взаимодействует с линейными пептидных антигенов, представленных MHC (человек ортолог HLA) молекул (ПКИКЖ комплексов) в специфической и чувствительной манере, чтобы обеспечить сигналы, которые инициируют функцию клеток эффекторных Т. Биохимические параметры TCR взаимодействия с ПКИКЖ лигандов обеспечить не только специфику для Tклеточной активации, но также имеют качественную воздействие на последующее функции Т-клеток 2. Таким образом, изучение функции Т-клеток часто требуется рассмотрении ответов на клоновых Т-клеток с определенной антигенной специфичности.
Человек Т-клеток отсек, содержащий приблизительно 10 12 αβ Т-клеток, содержит примерно 10 7 – 10 8 различных αβTCRs 3-4. Это Разнообразный репертуар предоставляет возможность для признания огромного массива пептидов из потенциальных патогенов, что бы потребовать ответа Т-клеток для защитного иммунитета. Подсчитано, что частота Т-клеток в ответ на заданном чужеродного антигена, представленного себя MHC составляет порядка 10 -4 – 10 -7 при отсутствии предварительного иммунного ответа на этот антиген 5. Наивный Т-клеток репертуар формируется тимуса отбора, чтобы обеспечить способность распознавать собственного MHC представляя пептидные антигены и ограничения реагироватьivity против самостоятельных пептид антигенов, максимизации потенциальной полезности для посреднических защитный иммунитет 2. Тем не менее, в нарушение этого разработана реактивность, относительно большой частоты, 10 -3 – 10 -4, Т-клеток от иммунологически наивных лиц реагировать на стимуляцию с аллогенных клеток, признавая обе иностранные молекулы МНС, а также эндогенные пептиды они представляют 6. Признание аллогенных лигандов ПКИКЖ структурно похож на признании иностранных антигенов, представленных самостоятельной МНС; TCR имеет критические биохимические взаимодействия как с аллогенной молекулы МНС, а также представленного пептидом 7. Прочный характер ответа Т-клеток к аллогенных результатов стимуляции из разнообразия рМНС комплексы, присутствующие на поверхности аллогенных клеток 8. Подсчитано, что каждый представляет МНС примерно 2 х 10 4 различные эндогенные пептидные антигены 9. Это бreadth реакции на аллогенной стимуляции является существенным аспектом клинически соответствующей патологии, такие как отторжение аллотрансплантата или трансплантат против хозяина (РТПХ), в результате Т-клеток аллореактивность.
Изучение человека Т-клеток аллореактивными ответов традиционно полагались на рассмотрении поликлональные ответы наивных Т-клеток после стимуляции аллогенных клеток. Повторные стимуляции с одной и той же линии аллогенных клеток в сочетании с ограниченным разбавлением анализ способен генерировать клоновых Т-клеток с определенной признания аллогенной HLA 10. Тем не менее, этот подход является проблематичным для изучения ответов на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ, как большой и разнообразный репертуар эндогенного рМНС комплексы присутствует при заданном аллогенных HLA стимулирует широкий репертуар Т-клеток. Это возбуждение масса населения и ограничение подход потребует разбавления скрининг большого числа клонов, чтобы изолировать Т-клеток с желаемым реакционномVity против одного ПКИКЖ лиганда. Кроме того, частота Т-клеток, отвечающих на индивидуальной аллогенной ПКИКЖ лиганда является относительно низким среди наивных Т-клеточных популяций, который представляет собой барьер для эффективной генерации клонов Т-клеток человека, реагирующих на данному антигену.
Выявление и изоляция антиген-специфических Т-клеток из поликлональных популяций были включены по развитию флуорофорных меченных ПКИКЖ мультимерами 11. Этот подход использует определенные пептидные антигены загруженные в рекомбинантных растворимых биотинилированных молекул МНС, которые помечены путем связывания с стрептавидин-меченого флуорофора. Мультимеризации рМНС увеличивает алчность, компенсируя неразрывно низкий (мкм) сродства TCR для растворимых лигандов ПКИКЖ. Меченые клетки могут быть идентифицированы и выделены с помощью проточной цитометрии. Тем не менее, этот подход все еще ограничено низкой частоты антиген-специфических Т-клеток среди населения наивных Т-клеток, которые, как правило,порядков меньше, чем предел точной идентификации и количественного определения на большинстве цитометров. Для решения этой ограничение, метод ПКИКЖ тетрамера маркировки и последующего обогащения магнитного бисера для тетрамерных-меченых клеток были разработаны 12. Этот метод показал, надежное обнаружение, перечисление, и выделение низкочастотных антиген-специфических Т-клеток.
Этот протокол описывает эффективный протокол для генерации клонов Т-клеток человека, которые специфически реагируют на отдельных лигандов аллогенных ПКИКЖ. Протокол применяется ПКИКЖ (HLA) мультимера маркировки и обогащение для выделения Аллоантиген-специфический Т-клеток человека с проточной цитометрии сортировки клеток и надежный метод для культуры в пробирке человеческих Т-клеток, чтобы обеспечить выпуск клонов Т-клеток из отдельных отсортированных клеток ( Обзор на рисунке 1).
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
The authors have nothing to disclose.
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
HEPES | Corning | 25-060-CI | |
b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
Media | |||
Cell sorting buffer | |||
PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
BSA | 10g | ||
EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
Human T Cell Culture Medium | |||
Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
HEPES (1 M) | 4 ml | ||
Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |