דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי
Summary
This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.
Abstract
The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.
Introduction
לימפוציטים מסוג T הם רכיבים קריטיים של המערכת החיסונית אדפטיבית. תאי T אחראים ללא רק ישירות תיווך תגובות חיסוניים הגנתיות לפתוגנים באמצעות מגוון רחב של מנגנוני מפעיל, אלא גם באופן פעיל שמירה על סובלנות עצמית חיסונית ומכוון את התגובות של תאים אחרים במערכת החיסונית. פונקציות אלה מופנות דרך מספר האותות משולבים, כולל קולטן תא T קשירה (TCR), ציטוקינים וכמוקינים, ומטבוליטים 1. האותות הללו, TCR הוא בעלת חשיבות מיוחדת, כפי שהוא מספק את הספציפיות האופייניות שמגדירה את התפקיד של תאי T בחסינות אדפטיבית. TCR אינטראקציה עם אנטיגנים פפטיד ליניארי שהוצגו על ידי MHC (HLA ortholog אדם) מולקולות (מתחמי pMHC) באופן ספציפי ורגיש מאוד לתת את האותות שליזום פונקצית מפעיל של תאי T. הפרמטרים ביוכימיים של אינטראקציות TCR עם הליגנדים pMHC לספק לא רק את הספציפיות לTהפעלת תא, אלא גם יש לו השפעה איכותית על תפקוד תאי T שלאחר מכן 2. כך, תפקוד התא T לומד לעתים קרובות דורש שבוחן את התגובות של תאי T המשובט עם סגוליות אנטיגני מוגדרות.
התא האנושי T התא, המכיל כ 10 12 תאי T αβ, מכיל 10 7 מוערך – 10 8 αβTCRs שונה 3-4. רפרטואר מגוון זה מספק הזדמנות להכרה במגוון הרחב של פפטידים מפתוגנים פוטנציאליים שיחייב תגובה של תאי T לחסינות. ההערכה היא כי התדירות של תאי T מגיבה לאנטיגן הזר נתון שהוצג על ידי עצמי MHC היא בסדר הגודל של 10 -4 – 10 -7 בהעדר תגובה חיסונית לפני אנטיגן כי 5. הרפרטואר של תאי T הנאיבי מעוצב על ידי בחירת הרתי כדי להבטיח את היכולת לזהות עצמי MHC הצגת אנטיגנים פפטיד ומגבלה להגיבivity נגד אנטיגנים עצמי פפטיד, למקסם את התועלת הפוטנציאלית לתיווכם חסינות 2. עם זאת, בניגוד לזו שנועד תגובתיות, תדירות גבוהה יחסית, 10 -3 – 10 -4, תאי T מאנשים מערכת חיסון נאיביים להגיב לגירוי עם תאים אלוגנאית, הכרת שתי מולקולות MHC הזרות, כמו גם פפטידים אנדוגני שהם מציגים 6. ההכרה של הליגנדים pMHC אלוגנאית דומה מבנית להכרה של אנטיגנים זרים שהוצגו על ידי עצמי MHC; TCR עושה אינטראקציות ביוכימיים קריטיות עם שתי מולקולת MHC אלוגנאית, כמו גם את הפפטיד מוצג 7. הטבע חזק של התגובה של תאי T לתוצאות גירוי אלוגנאית מהמגוון של pMHC קומפלקסים קיימים על פני השטח של תאים אלוגנאית 8. הערכה היא כי כל MHC מציג כ 2 x 10 4 אנטיגנים פפטיד אנדוגני שונים 9. ב זהreadth של תגובה לגירוי אלוגנאית הוא היבט משמעותי של פתולוגיה הקלינית הרלוונטית, כגון דחיית שתל או שתל לעומת המחלה מארח (GVHD), כתוצאה מalloreactivity תא T.
מחקר של תגובות תא אנושיות T alloreactive הסתמך באופן מסורתי על בחינת תגובות polyclonal של תאי T נאיביים בעקבות גירוי עם תאים אלוגנאית. גירוי חוזר ונשנה עם אותו קו התא אלוגנאית בשילוב עם הגבלת דילול מנתח הוא מסוגל לייצר תאי T משובטים עם הכרה מוגדרת של אלוגנאית HLA 10. עם זאת, גישה זו היא בעייתית לבחינת תגובות לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד, כרפרטואר הרחב והמגוון של pMHC אנדוגני קומפלקסים נוכחי לאלוגנאית נתון HLA מגרה רפרטואר רחב של תאי T. גירוי האוכלוסייה בתפוצה רחבה וגישת דילול מגבילה ידרשו הקרנה של מספר הגדול של שיבוטים לבודד תאי T עם Reacti הרצויvity נגד יגנד pMHC יחיד. בנוסף, התדירות של תאי T מגיבים ליגנד pMHC אלוגנאית בודד היא נמוכה יחסית בקרב אוכלוסיות נאיביות תא T, המציגה מחסום לדור יעיל של שיבוטים תא T אנושיים מגיבים לאנטיגן נתון.
זיהוי ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי מאוכלוסיות polyclonal שהופעלו על ידי הפיתוח של multimers pMHC fluorophore שכותרתו 11. גישה זו משתמשת אנטיגנים פפטיד ספציפיים נטענים לתוך מולקולות מסיסה רקומביננטי biotinylated MHC, שמסומנים על ידי ההיקשרות לfluorophore שכותרתו streptavidin. Multimerization של pMHC מגביר את הלהיטות, מפצה על זיקת מיסוד נמוך (מיקרומטר) של TCR להליגנדים pMHC מסיסים. ניתן לזהות תאים שכותרתו ומבודדים על ידי cytometry זרימה. עם זאת, גישה זו עדיין מוגבלת על ידי התדירות הנמוכה של תאי אנטיגן הספציפי T בין אוכלוסיות תאי T נאיביות, אשר בדרך כללסדרי הגודל פחות מהמגבלה של זיהוי וכימות מדויקים ברוב הזרימה cytometers. כדי לתת מענה למגבלה זו, שיטת תיוג pMHC tetramer והעשרת חרוז מגנטית שלאחר מכן לתאים שכותרתו tetramer פותחה 12. שיטה זו הוכיחה זיהוי אמין, ספירה, ובידוד של תאי T אנטיגן ספציפי בתדירות נמוכה.
פרוטוקול זה מתאר פרוטוקול יעיל לייצור השיבוטים תא T האנושיים שדווקא מגיבים לליגנד pMHC אלוגנאית הבודד. הפרוטוקול חל pMHC (HLA) תיוג והעשרת multimer לבידוד של תאי T האנושיים alloantigen הספציפי עם cytometry זרימת תא מיון ושיטה חזקה לתרבות במבחנה של תאי T אנושיים כדי לאפשר ייצור של שיבוטים תא T מהתאים ממוינים אחת ( סקירה באיור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
T cell alloreactivity is a long-studied and clinically-relevant phenomenon. The robust proliferative and effector responses of T cells to allogeneic stimulation has enabled extensive analyses of human T cell responses in vitro through relatively straightforward mixed lymphocyte reactions of peripheral blood T cells against inactivated allogeneic cells. However, these primary alloreactive T cell responses are oligoclonal, comprised of a large number of individual T cells responding to specific alloantigens. This …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The author would like to thank the NIH Tetramer Core Facility for tetramer production. The author would also like to thank E.D. O’Connor and K.E. Marquez at the UCSD Human Embryonic Stem Cell Core Facility flow cytometry laboratory for assistance in cell sorting. This work was funded by National Institutes of Health grant K08AI085039 (G.P.M.).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Sodium heparin venous blood collection tube 16 x 100 mm | Becton, Dickenson and Company | 366480 | |
| Lymphoprep | Stemcell Technologies | 7801 | |
| Rosette Sep Human T Cell Enrichment Kit | Stemcell Technologies | 15061 | |
| Dulbecco's PBS, 1x without Ca or Mg | Corning | 21-031-CV | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6635 | |
| Fluorophore-labeled pMHC tetramer | NIH Tetramer Facility | NA | |
| EasySep Biotin Selection Kit | Stemcell Technologies | 18553 | |
| EasySep Selection magnet | Stemcell Technologies | 18000 | |
| TruStain FcX Human Fc blocking solution | Biolegend | 422301 | |
| Anti-CD5 PE-Cy7 (clone UCHT2) | Biolegend | 300621 | |
| Anti-CD14 FITC (clone HCD14) | Biolegend | 325603 | |
| Anti-CD19 FITC (clone HIB19) | Biolegend | 302205 | |
| Iscove's DMEM, without b-ME or L-glutamine | Corning | 15-016-CV | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| b-Mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Gentamicin sulfate (50 mg/ml) | Omega Scientific | GT-50 | |
| Human AB serum, male donor | Omega Scientific | HS-30 | |
| Recombinant human IL-2 | Peprotech | AF 200-02 | |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 | Life Technologies | 11131D | |
| Media | |||
| Cell sorting buffer | |||
| PBS, pH 7.4 | 1 L | ||
| BSA | 10g | ||
| EDTA (0.5 M) | 2 ml | ||
| Human T Cell Culture Medium | |||
| Iscove's DMEM | 351.6 ml | ||
| Heat-inactivated human AB serum | 40 ml | ||
| HEPES (1 M) | 4 ml | ||
| Glutamax (100 x) | 4 ml | ||
| Gentamicin (50 mg/ml) | 0.4 ml | ||
| b-mercaptoethanol (14.3 M) | 1.4 ml | ||
| Recombinant human IL-2 (1 mg/ml) | 1 ml |
Riferimenti
- Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. S. T cell activation. Annu. Rev. Immunol. 27 (1), 591-619 (2009).
- Morris, G. P., Allen, P. M. How the TCR balances sensitivity and specificity for the recognition of self and pathogens. Nat. Immunol. 13 (2), 121-128 (2012).
- Arstilla, T. P., et al. A direct estimation of the human αβ T cell receptor diversity. Science. 286 (5441), 958-961 (1999).
- Robbins, H. S., et al. Comprehensive assessment of T-cell receptor β-chain diversity in αβ T cells. Blood. 114 (19), 4099-4107 (2009).
- Alanio, C., Lemaitre, F., Law, H. K. W., Hasan, M., Albert, M. L. Enumeration of human antigen-specific naive CD8+ T cells reveals conserved precursor frequencies. Blood. 115 (18), 3718-3725 (2010).
- Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J. Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
- Felix, N. J., Allen, P. M. Specificity of T-cell alloreactivity. Nat. Rev. Immunol. 7 (12), 942-953 (2007).
- Morris, G. P., Ni, P. P., Allen, P. M. Alloreactivity is limited by the endogenous peptide repertoire. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 108 (9), 3695-3700 (2011).
- Suri, A., et al. In APCs, the autologous peptides selected by the diabetogenic I-Ag7 molecule are unique and determined by the amino acid changes in the P9 pocket. J. Immunol. 168 (3), 1235-1243 (2002).
- Yssl, H., Spits, H. Generation and maintenance of cloned human T cell lines. Curr. Protoc. Immunol. 7, (2002).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
- Moon, J. J., et al. Naive CD4+ T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude. Immunity. 27 (2), 203-213 (2007).
- Chicz, R. M., et al. Specificity and promiscuity among naturally processed peptides bound to HLA-DR alleles. J. Exp. Med. 178 (1), 27-47 (1993).
- Ni, P. P., Allen, P. M., Morris, G. P. The ability to rearrange dual TCRs enhances positive selection, leading to increased allo- and autoreactive T cell repertoires. J. Immunol. In press, (2014).
- Morris, G. P., Uy, G. L., Donermeyer, D., DiPersio, J. F., Allen, P. M. Dual receptor T cells mediate pathologic alloreactivity in patients with acute graft-versus-host disease. Sci. Transl. Med. 5 (188), (2013).
- Altman, J. D., Reay, P. A., Davis, M. M. Formation of functional peptide complexes of class II major histocompatibility complex proteins from subunits produced in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90 (21), 10330-10334 (1993).
- Sabatino, J. J., Huang, J., Zhu, C., Evavold, B. D. High prevalence of low affinity peptide-MHC II tetramer-negative effectors during polyclonal CD4+ T cell responses. J. Exp. Med. 208 (1), 81-90 (2011).
