Génération de cellules T humaines allo-spécifiques du sang périphérique

Les lymphocytes T sont des composantes essentielles du système immunitaire adaptatif. Les cellules T sont responsables de la médiation directement non seulement des réponses immunitaires protectrices à des agents pathogènes à travers une variété de mécanismes effecteurs, mais également le maintien activement auto-tolérance immunologique et diriger les réponses des autres cellules dans le système immunitaire. Ces fonctions sont dirigés à travers un certain nombre de signaux intégrés, y compris des récepteurs de cellule T (TCR) ligature, les cytokines et les chimiokines, et les métabolites ^1. Parmi ces signaux, le TCR est d'une importance particulière, car il fournit la spécificité caractéristique qui définit le rôle de la cellule T dans l'immunité adaptative. Un TCR interagit avec les antigènes peptidiques linéaires présentés par le CMH (HLA de orthologue humain) molécules (complexes de pMHC) d'une manière hautement spécifique et sensible pour fournir les signaux qui déclenchent la fonction T effectrice des cellules. Les paramètres biochimiques des interactions TCR avec des ligands PMHC fournissent non seulement la spécificité de Tl'activation des cellules, mais aussi avoir un impact qualitatif sur la fonction des cellules T ultérieur ^2. Ainsi, l'étude de la fonction des cellules T nécessite souvent l'examen des réponses de lymphocytes T clonaux ayant une spécificité antigénique déterminée.

Le compartiment des cellules T humaines, contenant environ 10 ¹² cellules T αβ, contient environ ^{7 octobre au 8 octobre} αβTCRs distinctes ^3-4. Ce répertoire très diversifié offre la possibilité de reconnaissance de la vaste gamme de peptides de pathogènes potentiels qui nécessiterait une réponse des cellules T à une immunité protectrice. On estime que la fréquence de la réponse des cellules T à un antigène étranger présenté donné par auto-MHC est de l'ordre de 10 ^-4 à 10 ^-7 en l'absence de réponse immunitaire à cet antigène avant ^5. Le répertoire des lymphocytes T naïfs est formée par sélection thymique à assurer la capacité de reconnaître des auto-antigènes MHC de présentation de peptides et de limite réagissentivité contre les antigènes auto-peptide, la maximisation de l'utilité potentielle de la médiation de l'immunité protectrice ^2. Cependant, en violation de cette réactivité conçu, une fréquence relativement importante, 10 ^-3 à 10 ^-4, de cellules T d'individus immunologiquement naïfs répondre à une stimulation avec des cellules allogéniques, reconnaissant à la fois les molécules du CMH étrangers ainsi que les peptides endogènes qu'ils présentent ^6. La reconnaissance de ligands PMHC allogéniques est structurellement similaire à la reconnaissance d'antigènes étrangers présentés par CMH du soi; du TCR permet d'interactions biochimiques essentiels à la fois avec la molécule MHC allogénique aussi bien que le peptide présenté ^7. La robustesse de la réponse des cellules T aux résultats de stimulation allogéniques de la diversité de complexes de pMHC présent sur ​​la surface des cellules allogéniques ^8. On estime que chaque CMH présente à environ 2 x 10 ⁴ différents antigènes peptidiques endogènes ^9. Ce breadth de réponse à une stimulation allogénique est un aspect important de la pathologie cliniquement pertinentes, telles que le rejet d'allogreffe ou la réaction du greffon contre l'hôte (GVHD), résultant de T alloréactivité cellulaire.

Étude de cellules T réponses alloréactives humaines a toujours compté sur l'examen des réponses polyclonaux de cellules T naïves après stimulation avec des cellules allogéniques. Stimulation répétée avec la même lignée cellulaire allogénique combiné avec dilution limitante analyse est capable de générer des cellules T clonales de reconnaissance définis allogénique HLA de ^10. Cependant, cette approche est problématique pour examiner les réponses aux différents ligands PMHC allogéniques, comme le répertoire vaste et diversifié de endogène pMHC complexes présente un allogénique HLA donné stimule un large répertoire de cellules T. Cette stimulation de la population en vrac et en limitant approche de dilution, il faudrait dépistage d'un grand nombre de clones pour isoler les cellules T avec la Reacti souhaitéevité contre un seul ligand pMHC. En outre, la fréquence des cellules T répondant à un ligand pMHC allogénique individu est relativement faible chez les populations de cellules T naïves, qui présente un obstacle à la génération efficace de clones de lymphocytes T humains en réponse à un antigène donné.

L'identification et l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène à partir de populations polyclonales ont été activées par le développement de multimères pMHC ¹¹ marqué par un fluorophore. Cette approche utilise des antigènes peptidiques spécifiques chargés dans des molécules de CMH solubles recombinants biotinylés, qui sont marqués par liaison à un fluorophore de la streptavidine marquée. Multimérisation de pMHC augmente l'avidité, la compensation de l'affinité intrinsèquement faible (M) de TCR pour ligands PMHC solubles. Les cellules marquées peuvent être identifiées et isolées par cytométrie de flux. Cependant, cette approche est encore limitée par la faible fréquence des cellules T spécifiques de l'antigène chez les populations de cellules T naïves, qui sont typiquementordres de grandeur inférieure à la limite de l'identification et quantification précise sur la plupart des cytomètres de flux. Pour remédier à cette limitation, un procédé de marquage pMHC de tétramère et d'enrichissement par billes magnétiques subséquente des cellules tétramère marqué a été mis au point ^12. Cette méthode a montré une détection fiable, le dénombrement et l'isolement des cellules T spécifiques de l'antigène à basse fréquence.

Ce protocole décrit un protocole efficace pour la génération de clones de cellules T humains qui réagissent spécifiquement aux ligands individuels pMHC allogéniques. Le protocole applique pMHC (HLA) l'étiquetage des multimères et d'enrichissement pour l'isolement de cellules T humaines spécifiques à l'alloantigène de cytométrie de flux de tri cellulaire et un procédé robustes pour la culture in vitro de cellules T humaines pour permettre la production de clones de cellules triées individuelles de cellules T ( Vue d'ensemble de la figure 1).