توضح هذه المقالة بالتفصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين في E14.5 في الفئران. علينا أن نبين أن هذا هو وسيلة قيمة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.
في electroporation الرحم (IUE) أصبحت تقنية قوية لدراسة تطوير مناطق مختلفة من الجهاز العصبي الجنيني 1-5. ولم يتم حتى الآن هذه الأداة المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تنظيم الانتشار الخلوي، والتمايز وهجرة الخلايا العصبية وخصوصا في القشرة الدماغية النامية 6-8. هنا نحن لدينا تفاصيل بروتوكول لelectroporate في الرحم قشرة الدماغ والحصين، وتقديم الأدلة التي يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في هاتين المنطقتين الدماغي.
وقد ساهمت التصور والتلاعب في الخلايا العصبية في الثقافات الأولية إلى فهم أفضل للعمليات المشتركة في التغصنات، العمود الفقري والتنمية المشبك. ومع ذلك لا تتعرض الخلايا العصبية المتزايدة في المختبر إلى العظة جميع الفسيولوجية التي يمكن أن تؤثر التغصنات و / أو تشكيل العمود الفقري والصيانة خلال التطور الطبيعي. معرفتنا للهياكل التغصنات والعمود الفقري <eم> المجراة على الفئران البرية من نوع أو متحولة ويأتي معظمها من الملاحظات باستخدام طريقة جولجي كوكس 9. ومع ذلك، يعتبر جولجي تلطيخ لتكون غير متوقعة. في الواقع، وصفت مجموعة من الخلايا العصبية ومساحات الألياف عشوائيا، مع مناطق معينة تظهر في كثير من الأحيان الملون تماما بينما المناطق المتاخمة خالية من تلطيخ. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن IUE من بنيات فلوري يمثل طريقة جذابة بديل لدراسة التشعبات، العمود الفقري، فضلا عن نقاط الاشتباك العصبي في فئرانا معدلة وراثيا / البرية من نوع 10-11 (الشكل 1A). وعلاوة على ذلك بالمقارنة مع جيل من الماوس بالضربة القاضية، IUE يمثل نهجا السريع لأداء الربح والخسارة من وظيفة في دراسات سكانية محددة من الخلايا خلال نافذة زمنية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، تم IUE استخدمت بنجاح مع التعبير الجيني محرض أو محرض رني تقترب لتحسين السيطرة الزمنية على التعبير عن الجينات أو shRNA 12. هذه المزايا من IUE وبالتالي openeد أبعادا جديدة لدراسة تأثير في التعبير الجيني / قمع في التشعبات والعمود الفقري، ليس فقط في هياكل محددة الدماغي (1B الشكل)، ولكن أيضا في نقطة زمنية محددة للتنمية (الشكل 1C).
أخيرا، IUE يوفر أداة مفيدة لتحديد تفاعلات وظيفية بين الجينات المسؤولة عن التغصنات، العمود الفقري و / أو تطوير المشبك. في الواقع، خلافا لغيرها من وسائل نقل الجينات مثل الفيروس، وذلك واضح ومباشر على الجمع بين رني متعددة أو الجينات المحورة في نفس السكان من الخلايا.
وخلاصة القول، IUE هو وسيلة قوية التي سبق أن ساهمت في توصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء وظيفة الدماغ والمرض، وأنه ينبغي أن يكون مفيدا أيضا في دراسة التشعبات والعمود الفقري.
IUE هو أداة قوية لمعالجة الجينات، ليس فقط في الفضاء ولكن أيضا في الوقت المناسب. نعرض هنا يمكن أن تستخدم هذه التقنية لتصور والتلاعب وراثيا التشعبات والعمود الفقري في قشرة الدماغ والحصين من الفئران. بالإضافة إلى المزايا المذكورة سابقا، ومن الجدير بالذكر أن IUE، على النقيض من غولجي الأسلوب، يمكن دمجها مع المناعية أو في التهجين في الموقع، والذي يسمح على سبيل المثال إلى النمط الظاهري للخلايا electroporated. من المهم أيضا أن نذكر أن هذا الإجراء لا يسبب تشوهات في المخ واضح على الرغم من الغازية النسبي. وبالإضافة إلى ذلك، على المستوى الخلوي، IUE لا تعديل خصائص الكهربية للخلايا العصبية electroporated 13. في حين يركز على مظاهرة لدينا تصور morphologies التغصنات والعمود الفقري، يمكن أيضا IUE من العصبونات القشرية أو قرن آمون في E14.5 أن تستخدم لدراسة أحداث التنموية الأخرى مثل تشكيل محور عصبي والتوجيه. في إضافةويمكن تنفيذ ition، نفس النوع من بروتوكول في مراحل أخرى من التطور الجنيني لاستهداف مجموعات سكانية مختلفة. على سبيل المثال، يمكن تنفيذ نموذجا تنمويا electroporation جدا القشرية في وقت متأخر من E18.5 لدفع التعبير في الأسلاف نجمي 1. وبالمثل، في حين أن electroporation من قرن آمون في E14.5 يسمح لاستهداف CA1-CA3 أسلاف الخلايا العصبية الهرمية والمسنن السلف الخلية الحبيبية في الوقت نفسه، فإن electroporation أواخر قرن آمون (E18.5 أو بعد الولادة في وقت مبكر) تسمح لاستهداف حبيبة المسنن مختلفة الأسلاف 14. في هذه الحالة، يمكن زيادة حجم حقن الحمض النووي، فضلا عن شدة التيار.
الجينات المحورة التي أدخلها IUE يبدو أن تظل episomal وخسر بالتالي من الخلايا بعد الانقسامات الخلوية المتتالية. في الخلايا تالية للتفتل مثل الخلايا العصبية، ومع ذلك، فإن الجينات المحورة episomal تبقى نشطة لعدة اشهر بعد electroporation السماح للدراسات طويلة الأجل 13، 15. في دراستنا، لاحظنا GFP مشرق + الخلايا تصل إلى 7 أسابيع بعد الولادة (نقطة آخر مرة قمنا بتحليل) تشير إلى أن الجنينية استهداف السلائف العصبية القشرية أو قرن آمون استخدام نتائج IUE في التعبير المستمر للالتحوير في وقت مبكر من نقاط حتى وقت التنموية إلى سن البلوغ.
وجود قيود الحالي للتقنية هو أنه من الصعب ممارسة دفع غرامة السيطرة على العدد الكلي للخلايا electroporated. ومع ذلك، من خلال خفض حجم حقن محلول الحمض النووي، وأظهرنا أنه من الممكن ان تصف خلايا قليلة، وعلى تصور تشجر شجيري من خلايا منعزلة + GFP وكذلك العمود الفقري لها. ويمكن أيضا البعد عن منطقة transfected يمكن تعديلها عن طريق تعديل المعلمات من electroporation مثل شدة التيار وعدد من البقول أو القطر من المجاذيف electroporation.
تماما IUE هو طريقة التي هي سهلة لتنفيذ وسريعة وفعالة لدراسة التشعبات والعمود الفقري في الجسم الحي.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور كاثلين ماذرز، والدكتور Mocho جان فيليب، والدكتور يولاندا توريس سافيدرا لمساعدتهم على أداء electroporation في الرحم في إطار الإجراءات العقيم، وخشب هايلي لمساعدتها في إعداد المخططات.
وأيد البرلمان الأوروبي من قبل الاتحاد على المدى الطويل لجمعيات الكيمياء الحيوية الأوروبية (FEBS) زمالة ومجلس البحوث الطبية والتطوير الوظيفي (MRC) زمالة، MAH بمنحة يلكوم ترست لفيشر وإليزابيث Tybulewicz فيكتور (080174/B/06/Z) ، الأب من قبل زمالة طويلة الأجل EMBO والتهاب المفاصل الروماتويدي عن طريق منحة دراسية لجنة نهر الميكونج. وأيد هذا العمل من خلال منحة المشروع من ويلكوم ترست (086947/Z/08/Z) وقبل FG غرانت في والمعونة من مجلس البحوث الطبية (U117570528) إلى
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments | |||
Preparation of needles and DNA solution for injection | ||||||
Endofree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | ||||
Fast Green | Sigma | F-7258 | ||||
Borosilicate glass capillaries 1.0 mm O.D. x 0.58 mm I.D. |
Harvard Apparatus | 30-0016 | ||||
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | For Eppendorf pipettes 0.5 μl-10 μl / 2-20 μl | |||
Material for surgery | ||||||
Extra thin Iris scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | ||||
Curved Forceps | Fine Science Tools | 91197-00 | ||||
Ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | ||||
Needle holder | Fine Science Tools | 12002-12 | ||||
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11050-10 | ||||
Vicryl absorbable suture | Ethicon Inc (Johnson & Johnson) | W9074 | ||||
Sterile drapes 30cm x 45 cm | Buster | 141765 | ||||
Sterile swabs | Shermond | HUBY-340 | ||||
Cotton buds | Clean Cross Co., Ltd | 1860 | ||||
Buprenorphine (Vetergesic) | Alstoe Animal Health | |||||
Clorhexidine | Vetasept | XHG007 | ||||
Eye gel Viscotears | Novartis | |||||
Isoflurane | Abbott Laboratories | B506 | ||||
Pentoject, Pentobarbitone Sodium 20% | Animalcare | |||||
Electroporation | ||||||
Electroporator | BTX | ECM830 | ||||
Platinum Tweezertrode 5mm | BTX, Harvard Apparatus | 45-0489 | ||||
Femtojet microinjector | Eppendorf | 5247000030 | ||||
Foot Control for Femtojet Microinjector | Eppendorf | 5247623002 | ||||
Capillary holder | Eppendorf | 5176190002 | ||||
Tissue processing | ||||||
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | ||||
Sucrose | VWR (Prolabo) | 27480.294 | ||||
Microscope slides | ThermoScientific (Menzel-Gläser) | J1800AMNZ | ||||
Coverslips | Menzel-Gläser | 22 x 50 mm #1,5 | ||||
Aqua Poly/mount | Polysciences, Inc | 18606 |