السيتوكروم عدوى من الفئران مع اتش معربا عن مستضد ذاتي الإنسان الرئيسية 2D6 P450 (hCYP2D6) معترف بها من قبل الأمصال من المرضى الذين يعانون من التهاب الكبد من النوع 2 نتائج المناعة الذاتية في شكل مستمر من مرض في الكبد المناعة الذاتية بوساطة تتميز اسعة تليف والتهاب الكبد وجيل من CYP2D6 محددة استجابة مناعية.
التهاب الكبد الذاتية هو مرض نادر ولكن يهدد الحياة الذاتية الكبد من 1،2 مرض غير معروف. في محاولات عديدة في الماضي بذلت لتوليد نموذج حيواني التي تعكس خصائص الأمراض التي تصيب البشر 3-5. ومع ذلك، في نماذج مختلفة كان الاستقراء من مرض معقد نوعا ما، وغالبا ما كان التهاب الكبد عابر فقط 3-5. ولذلك، قمنا بتطوير نموذج الفأر واضحة يستخدم مستضد ذاتي الإنسان الرئيسية في التهاب الكبد من النوع 2 المناعة الذاتية (AIH-2)، hCYP2D6 وهي بمثابة الزناد 6. اكتب 1 الكبد والكلى الأجسام المضادة الميكروسومي (LKM-1) الأجسام المضادة الاعتراف hCYP2D6 هي السمة المميزة لAIH-2 7،8. وكان تسليم hCYP2D6 إلى FVB wildtype أو C57BL / 6 الفئران عن طريق التصور اتش (AD-2D6) أن يضمن التسليم المباشر للمستضد التسبب في الكبد. وهكذا، فإن التهاب التي تلت المحلية يولد حقلا خصبا (9) لتطور لاحق من المناعة الذاتية. مكيفombination من الحقن في الوريد وداخل الصفاق من AD-2D6 هو الطريق الأكثر فعالية لإحداث ضرر طويل الأمد المناعة الذاتية للكبد (القسم 1). هنا نقدم بروتوكول مفصلة حول كيفية المناعة الذاتية والتي يسببها مرض الكبد في النموذج CYP2D6 وكيف يمكن تقييم الجوانب المختلفة لتلف الكبد. أولا، يتم تحديد مستويات المصل من علامات تشير إلى تدمير الكبدية، مثل aminotransferases، وكذلك التتر من hCYP2D6 الأجسام المضادة من قبل أخذ العينات retroorbitaly الدم (القسم 2). ثانيا، يتميز hCYP2D6 محددة استجابة الخلايا التائية من خلال جمع الخلايا الليمفاوية من الطحال والكبد. من أجل الحصول على الخلايا اللمفية الكبد نقي، وperfused في الكبد عن طريق برنامج تلفزيوني عن طريق الوريد البابي (قسم 3)، وهضمها في الكولاجين وتنقيته على مدى الانحدار Percoll (القسم 4). ويتم تحليل وتيرة خلايا تي hCYP2D6 محددة بواسطة التحفيز مع hCYP2D6 الببتيدات وتحديد IFNγ الخلايا المنتجة بواسطة التدفق الخلوي (القسم 5). الثالث،يتم تحديد تسلل الخلوية والمناعية بواسطة تليف الكبد من أقسام (القسم 6). مثل نظام تحليل لا بد ان تتم في عدة مرات بعد بدء المرض من أجل إثبات طبيعة المزمنة للنموذج. حجم الاستجابة المناعية التي تتسم وتيرة ونشاط من hCYP2D6 محددة T و / أو الخلايا البائية ودرجة تلف الكبد وتليف يجب أن يتم تقييمها لإجراء تقييم لاحق من العلاجات الممكنة لمنع وتأخير أو إلغاء للautodestructive عملية في الكبد.
في الدراسات السابقة، وذكر في كثير من الأحيان التهاب الكبد التجريبية لتكون نماذج فقط الحالية عابرة والعديد من أمراض الكبد الذاتية تعتمد على بروتوكولات مرض الاستقراء معقدة نوعا ما (لاستعراض رؤية 3،5). على سبيل المثال، عدة نماذج استخدام الفئران المعدلة وراثيا معربا عن مستضدات هدف محدد، ونقل adoptively الهدف مستضد معين، ومعظمها TCR-المعدلة وراثيا، وخلايا تي 14،15. في كثير من الأحيان وجود عدوى إضافية مع الفيروسات livertropic أو الجراثيم أو الطفيليات هو ضروري للحث على المرض 16-18. بدلا من ذلك، يتم استخدام الحمض النووي التطعيم مع البلازميدات ترميز لمستضدات الهدف، بما في ذلك CYP2D6 19، للحث على التهاب الكبد. ومع ذلك، ثمة حاجة إلى تطعيم إضافية مع البلازميدات ترميز للمحترفين للالتهابات السيتوكينات، مثل IL-12 و 20. للأسف، مع وجود استثناءات قليلة 15،20 التهاب الكبد هو عابر فقط.
نموذج CYP2D6 6،21 يستخدم تي طريقة مباشرةس تحفز التهاب الكبد المناعي اصابة ببساطة الفئران مع اتش معربا عن hCYP2D6، ومستضد ذاتي كبير في AIH-2 7،8. تسليم CYP2D6 من قبل التركيبة اتش يضمن كلا من الاستهداف المباشر من الكبد، فضلا عن التهاب المحلية التي تروج لانهيار التسامح. من المهم أن نلاحظ مع ذلك أن كلا من عيار الفيروس، فضلا عن طريقة التعاطي أمر حاسم لهذا النموذج. من ناحية، AD-2D6 هو فيروس نقص تكرارها، وبالتالي، لا بد من عيار كافية عالية من الفيروس لتوليد كمية حرجة من المستضد داخل الكبد. من ناحية أخرى، قد يكون باهظ عيار يؤدي إلى فشل الكبد الحاد المميت. وبالإضافة إلى ذلك، وقد تجلى ذلك في وقت سابق ان العدوى من الفئران بواسطة عيار عالية من اتش يؤدي إلى إنهاك وظيفي للاستجابة المناعية 22. في نموذجنا، وكنا مجموعة من العدوى عن طريق الوريد وداخل الصفاق من أجل الحصول على حد سواء تسلل مزمن الخلوية وكذلك تحويلةensive التليف. وقد لاحظنا أن العدوى عن طريق الوريد وحده لا يزال يسبب تسلل الخلوية هائلة، ولكن قد يكون متورطا لا تليف في المنطقة تحت المحفظة، مشيرا الى ان الالتهاب البريتوني نتيجة للحقن داخل الصفاق في تراكم مستمر وتحت المحفظة من الكولاجين (Hintermann وكريستين، مخطوطة في الإعداد). ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن التليف الكبدي الملاحظ هو مستضد معين، لأننا لم يكشف عن تنشيط الخلايا النجمية كبدي وترسب الكولاجين بعد الإصابة على قدم المساواة مع التتر للفيروسات من GFP-AD أو الإعلان لمراقبة 23.
نموذج CYP2D6 يعكس جوانب كثيرة من 1،2 AIH الإنسان، مثل التهاب الكبد المزمن يتميز تسلل الخلوية الثابتة، وتليف الكبد 6. وبالإضافة إلى ذلك، وجود أجسام مضادة لمكافحة CYP2D6 عالية عيار مع خصوصية حاتمة مماثلة، ونشر 13 إلى LKM-1 الأضداد الموجودة في AIH-2 المرضى يشير إلى ما قبلsence من التفاعل المشترك المناعة الذاتية المزمنة. CYP2D6 هو مستضد رئيسي في AIH-2، ولكن لم يتم التعرف عليه من قبل المرضى الذين شخصت مع AIH أكثر شيوعا من النوع 1. وبالإضافة إلى ذلك، المرضى الذين يعانون من أمراض الكبد الأخرى مع المسببات المناعة الذاتية، مثل التشمع الصفراوي الابتدائي (PBC) أو التهاب الأقنية الصفراوية المصلب الابتدائية (PSC)، وتوليد الأجسام المضادة السمة المميزة مع خصوصية لautoantigens الكبد متميزة وأكبادهم تظهر ملامح مرضية مختلفة تركز على الصغيرة (PBC ) أو كبير القناة الصفراوية (PSC). ومع ذلك، فإن النماذج CYP2D6 يتيح الفرصة لتحليل آليات immunopathogenic المشاركة في عمليات كبدي مزمن التهابات والتي تحدث أثناء أمراض الكبد الذاتية، لتحديد اللاعبين الرئيسيين التي تدفع تدمير المناعة الذاتية للخلايا الكبد، وتقييم التدخلات العلاجية الممكنة لعلاج هذا المرض.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم هذا العمل من قبل فرانكفورت غوته مستشفى الجامعة ومنحة من مؤسسة البحوث الألمانية إلى جامعة كاليفورنيا
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
23G needle | BD Biosciences | 300800 | |
27½G needle | VWR | 612-0151 | |
30½ G needle | BD Biosciences | 304000 | |
Alanine aminotransferase test strips (GPT/ALT) | Roche Diagnostics | 10 745 138 202 | |
Aspartate aminotransferase test strips (GOT/AST) | Roche Diagnostics | 10 745 120 202 | |
Anaesthesia Unit Univentor 400 | AgnTho’s | ||
Base molds, disposable 37x24x10 mm | VWR | 720-0208 | |
Cell strainer 70mm | VWR | 734-0003 | |
Cryostat | Leica | CM1850 UV | |
Heparinized capillary tubes | Fisher | 3123987 | |
Microscope slides Superfrost Plus | Menzel Gläser | J1800AMNZ | |
Microtainer SST tubes | BD Biosciences | 365951 | |
Microtiter plates, V-bottom | VWR | 391-1924 | |
Reflotron Plus | Roche Diagnostics | Determiniation of serum AST / ALT | |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Rabbit anti-mouse anti-Collagen type I IgG, | Chemicon | AB765P | |
Biotinylated goat anti-rabbit IgG | Vector (AXXORA) | VC-BA-1000-MC15 | |
FITC-conjugated anti mouse CD8a antibody | Southern Biotech | 1550-02 | |
PE-conjugated anti mouse IFNγ antibody | BD Biosciences | 554412 | |
PE-conjugated anti-mouse CD16/CD32 antibody (FcR block) | BD Biosciences | 553141 | |
Aquatex | VWR | 1.08562.0050 | |
Avidin/Biotin Blocking kit | Vector (AXXORA) | VC-SP-2001-KI01 | |
Brefeldin A | Sigma | B6542 | |
Collagenase IV | Sigma | C5138-100MG | |
DAB substrate kit 3’3’diaminobenzidine | Vector (AXXORA) | VC-SK-4100-KI01 | |
DNase | Sigma | DN-25 | |
Elite ABC Reagent | Vector (AXXORA) | VC-PK-7100-L050 | |
Eosin G/Y solution | Roth | X883.1 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom AG | S 0115 | |
Isofluran | Forene | B506 | |
Meyer’s Hematoxylin solution | AppliChem | A4840,1000 | |
OCT Compound | Sakura Finetek Europe | 4583 | |
PBS-buffered formaldehyde 10% | Roth | A146.3 | |
Percoll | Amersham | 17-0891-01 | |
Roti-Histokit | Roth | 6638.1 | |
RPMI | Invitrogen | 61870 | |
Saponin from quillaja bark | Sigma | S7900 |