CYP2D6 מודל החיה: כיצד לגרום דלקת כבד אוטואימונית עכברים

1. מתן תוך ורידי של 2D6-Ad לתוך הסינוס עיניים בתנאים סטריליים, לדלל את Ad-2D6 המניות וירוס הפתרון בריכוז של 5 X 10 9 pfu / מ"ל ב RPMI ולשמור פתרון Ad-2D6 וירוס על קרח. הזרקה של שני מינונים של 5 X 10 8 pfu (תוך ורידי ו intraperitoneal) הוכיחה לגרום התוצאה המהימנה ביותר של דלקת כבד אוטואימונית בעכברים של מתח FVB. להרדים עכבר עם 4% isoflurane בתא הרדמה. לצבוט את רגלו האחורית כדי לוודא שבעל החיים הוא מורדם. החזק את העכבר על החלק האחורי של הצוואר להדק את העור הרפוי של הראש עם האגודל והאמה. כך, העין הבולטת מעט על ידי המתיחה על העור הסמוך לעין. מכניסים את המחט בצורה אנכית לתוך canthus המדיאלי (צומת של העפעפיים הקרוב לאף של החיה) ולאט לאט להזריק 100 הפתרון μl Ad-2D6 וירוס. חשוב לא להפעיל לחץ רב מדי, כדילמנוע פגיעה של כלי שיט קנה הנשימה. לאט לאט למשוך את המחט, כדי למנוע דליפה ולסגור את העפעפיים. הזרקת עבד גם אם הפתרון וירוס לא לדלוף שוקת האף והעין גולשת בחזרה למצב ההתחלתי שלה. מיד לאחר ההזרקה לווריד, לבצע הזרקת intraperitoneal רמת 100 μl 2 של פתרון Ad-2D6 את הנגיף. לחלופין, הזרקה ניתן לבצע דרך וריד הזנב. עם זאת, באמצעות הזרקת סינוס עיניים הרבה יותר קל לביצוע, מצמצם את ההפסד של פתרון וירוס. הוכח כי שתי הטכניקות הללו ניתן להשתמש לסירוגין, וכי שני מסלולים יעילים באותה מידה 10. עכברים נגועים מנוטרים על תופעות לוואי או סימנים ברורים של סבל וכאב, כגון אובדן תיאבון, אובדן משקל, אובדן ניידות, אי החתן, פרווה גסה, כפוףההופעה, כמו גם ללקק, לנשוך, שריטה, או לוחץ על אזור מסוים (למשל באתר של ההזרקה). למרות העכברים להציג נזק גדול לכבד במודל CYP2D6, העכברים נראה בריא ולהראות סימנים של כאב או סבל, או לחץ. עם זאת, האינדיקטורים של אי ספיקת כבד חמורה, כגון aminotransferases בסרום נקבעים על בסיס קבוע או חלק הניסויים שבוצעו. רמות בסרום של aminotransferase> 1000 U / l צריך להופיע רק כתוצאה ישירה של זיהום בנגיף, אך לא באופן כרוני. אם רמות aminotransferase בסרום הם כרוניים מעל 1000 U / L (מגבלת חומרה) העכברים מוקרבים. 2. עין עכבר דימום להרדים עכבר עם 4% isoflurane בתא הרדמה. לצבוט את רגלו האחורית כדי לוודא שבעל החיים הוא מורדם. החזק את העכבר על החלק האחורי של הצוואר להדק את העור הרפוי של הראש עם האגודל והאמה. כך, העין הבולטת מעט על ידיהמתיחה על העור הסמוך לעין. הניחו את קצה צינור נימי בפינה התחתונה או הפנימי של העין בעדינות אך בתקיפות החליק לצד גלגל העין כדי סינוס ורידי עיניים. הקרע נימים ורידים ו דימום כתוצאה ממלא את חלל מסלולית. קצת למשוך את צינור נימי לשחרר עצה כך את הדם המצטבר הוא נשאב לתוך הצינור. כאשר כמות מספקת של דם נאסף, הצינור הוא מכונס העפעפיים סגורים. הדימום נפסק עם הנסיגה של הצינור ואת הקמתה מחדש של לחץ עינית רגילה על מורכבות ורידים. דם בצינור נימי מועבר צינור Microtainer ו מודגרות למשך 30 דקות על הקרח. צינור Microtainer הוא centrifuged ב XG 7500 דקות 2 ב 4 ° C. Supernatant מתאים בסרום אשר מועבר צינור טרי המאוחסן ב -80 ° C. סרום יכול לשמש כדי לקבוע כייל נוגדנים על ידי ELISA. Indicaממשיכי נזק לכבד כגון רמות בדם של אנזימי הכבד aminotransferase אלאנין (ALT / GPT) ו aspartate aminotransferase (AST / יש) ניתן להעריך באמצעות מקלוני הבדיקה על פי מ Roche Diagnostics (מנהיים, גרמניה) Reflotron פלוס Analyzer ( Roche Diagnostics, מנהיים, גרמניה). לחלופין, הדגימה דם ניתן לעשות זאת דרך וריד הזנב או דרך הווריד הטמפורלי השטחי 11. 3. הכבד עכבר זלוף הערה: שלב זה חשוב כדי למנוע זיהום כבד של לימפוציטים בודדים על ידי לימפוציטים בדם להרדים את העכבר על ידי מינונים קטלניים של CO 2 ואחריו פריקה צוואר הרחם. הר חיה להניח על גבו על לוח קלקר. השתמש 23 מחטים G כדי להצמיד הגפיים. לחות ולחטא את העכבר עם EtOH 70% כ 1 ס"מ במרחק של הרגליים האחוריות, לבצע חתך דרךאת העור ואת שכבת השריר. חותכים משני צידי החיה עבודה עד הסרעפת. כאשר הסרעפת הוא הגיע העור ניתן התהפך אחורה. חותכים את הסרעפת הרחק קורע את ולאחר מכן לחתוך את הווריד הנבוב. העבר את הקיבה ואת המעיים בצד, חושפת את הווריד הפורטל. ברוח פורטל להוסיף מחט 27 G מחובר מזרק 5 מ"ל מלא קר PBS. בואו PBS לאט לשטוף את הדם אל מחוץ לכבד. לנתח את הכבד על ידי גרירה אל הסרעפת חיתוך הסרעפת מהגוף. להעביר את הכבד לצלחת פטרי ולהסיר את הסרעפת, כיס המרה וכל רקמה אחרת עדיין מחובר אל הכבד להעביר את הכבד עד 10 מ"ל PBS בצינור 50 מ"ל על קרח או להטביע במתחם אוקטובר 4. הבידוד של לימפוציטים כבד הכן את הפתרונות המניות הבאות: Collagenase IV המניות (100 מ"ג / מ"ל) אניn PBS. (תן aliquots קטנים בחנות ב -20 ° C). DNase המניות (25 מ"ג / מ"ל) ב PBS. (תן aliquots קטנים בחנות ב -20 ° C). Collagenase חיץ: PBS המכיל 0.2 מ"ג / מ"ל collagenase הרביעי, 0.02 מ"ג / מ"ל ו DNase FCS 5%, על הכבד 1, מערבבים 9.5 קר כקרח מ"ל PBS, 20 μl collagenase IV (100 מ"ג / מ"ל המלאי), 8 DNase μl ( 25 מ"ג / מ"ל ​​מניות), ו – 500 μl חום מומת FCS. Percoll 35%, תערובת 175 מ"ל Percoll, 20 מ"ל 10 x PBS המניה, 305 מ"ל PBS. RPMI מלאה = RPMI המכיל 10% חום מומת FCS, μ 100 / מ"ל פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 2 מ"מ L-גלוטמין. להעביר את הכבד perfused (ראה סעיף 3) על 10 מ"ל של PBS טרי בצלחת פטרי על קרח וחותכים לחתיכות קטנות באמצעות מספריים. מעבירים לתוך מסננת 70 מיקרומטר תאים בכבד ג'ונקות להידחק דרך עם העלי זכוכית או העלי מ מזרק 2 מ"ל. בזהירות להוסיף 10 מ"ל חיץ collagenase קרלחץ דרך מסננת. איסוף ההשעיה ולסנן דרך מסננת פעמיים נוספות. להעביר את ההשעיה על צינור 50 מ"ל טריים על קרח. לעבד הכבד הבא. דגירה תא השעיה כבד על 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות, לערבב בעדינות כל 15 דקות. סרכזת XG ב 30 דקות 3 על 4 ° C. העברת supernatant לצינור טרי, עוזב 5 מ"מ נוזל מעל גלולה סרכזת ב XG 650 דקות 10 ב 4 ° C. מחק supernatant, והשאיר 3 מ"מ מעל גלולה Resuspend גלולה ב 20 מ"ל Percoll חיץ סרכזת ב XG 600 עבור 20 דקות ב 4 ° C. מחק supernatant ו resuspend גלולה ידי מצליף צינור. לשטוף גלולה 1 X עם PBS. לשטוף גלולה 1 X עם RPMI המלא Resuspend גלולה ב 3 מ"ל RPMI להשלים לספור תאים בדילול 1:10. תאים Resuspend ב ~~~HEAD=NNS 10 7 תאים / מ"ל RPMI להשלים ולהעביר צינור לקרח. </ol> 5. ציטוקינים מכתים תאיים (ICCS) 5.1 גירוי: הכן לימפוציטים הכבד בבית ~~~HEAD=NNS 10 7 תאים / מ"ל RPMI מלאה כמתואר. 100 μl פלייט (10 6 תאים) / גם לתוך צלחת שטוחה 96-היטב שאינו רקמות התרבות טיפול. הוסף 50μl RPMI להשלים המכיל 2μg/ml Brefeldin ולאחר מכן להוסיף 50μl RPMI שלם המכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל גירוי CYP2D6 פפטיד (כלומר את CD4 immunodominant epitope CYP2D6 41-60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12 או immunodominant CD8 epitope CYP2D6 193-212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12). מערבבים ידי pipetting. דגירה של 5 שעות ב 37 ° C (זמן הדגירה גירוי אופטימלי אבל עובד גם בלילה). 5.2. צביעה: הכן את הפתרונות המניות הבאות: FACS חיץ: PBS המכיל 1% של עוברי עגליםerum (FCS). קיבוע / Permeabilization חיץ: FACS מאגר המכיל 0.1% ו saponin paraformaldehyde 4% FACS / saponin חיץ כביסה: FACS מאגר המכיל saponin 0.1% FACS / PFA חיץ: FACS מאגר המכיל paraformaldehyde 1% (PFA) להעביר את התאים לתוך צלחת V-התחתונה microtiter (96 גם) ומסובב ב XG 460 דקות 3 ב 4 ° C. בטל בינוני הצלחת מערבולת הוסף 150 μl חיץ FACS ו צנטריפוגות ב XG 460 דקות 3 על 4 ° C. בטל בינוני הצלחת מערבולת. חזור על לשטוף את הצעד. השטח חסום FCR במידת הצורך (בעת שימוש משני נוגדנים) עם קוקטייל 1 αCD16/32 מיקרוגרם / מ"ל ​​(בלוק FCR) במאגר FACS במשך 15 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף 2 x 150 עם חיץ מכתים μl (460 XG דקות 2 ב 4 ° C). כתם של מולקולות על פני השטח: כלומר נגד CD8a-FITC MAB 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​במאגר FACS 50 μl למשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך. הוסף 100 μl FACSחיץ ספין על XG 460 דקות 3 ב 4 ° C. לשטוף תאים עם 2 x 150 חיץ FACS μl (460 XG, 3 דקות, 4 ° C). מערבולת צלחת. תקן / permeabilize תאים עם מאגר 100 קיבוע / permeabilization μl 10 דקות ב RT. מסובבים XG 460 דקות 7 ב 4 ° C. שים לב, חשוב להאריך את המועד צנטריפוגה ל 7 דק ', שכן קיבוע / צעדים permeabilzation משנה את הצפיפות הכוללת של התאים. מערבולת צלחת. לשטוף 2 x 150 עם FACS / μl בופר שטיפה saponin (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת. כתם על מולקולות תאיים: כלומר נגד IFNγ-PE MAB 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב -50 FACS / μl בופר שטיפה saponin למשך 30 דקות ב 4 ° C. הוסף 100 μl FACS / חיץ לשטוף saponin ומסובב ב XG 460 דקות 7 ב 4 ° C. לשטוף את התאים 2 x 150 עם FACS / μl בופר שטיפה saponin (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת. לשטוף את התאים 1 X עם FACS חיץ (460 XG, 7 דק ', 4 ° C). מערבולת צלחת. </lאני> תאים Resuspend ב -200 μl FACS / PFA חיץ, העברת לתוך צינורות, וחנות ב 4 ° C בחושך עד רכישת נתונים על ידי cytometry הזרימה. בדרך כלל אנחנו משתמשים ב 'FACSCanto או FACSCalibur (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). 6. אימונוהיסטוכימיה 6.1. H & E מכתים להערכת פתולוגיה כללית הכבד: הכבד קציר, לטבול רקמות Tek אוקטובר בתבנית בסיס חד פעמי הקפאה מהירה על קרח יבש. חותכים 7 חלקים רקמות הכבד מיקרומטר באמצעות cryostat Leica נקבע -17 ° C ו הר בסעיפים רקמות על Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות חנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. תקן cryosections שלפני מקורר EtOH במשך 15 דקות ב -20 ° C. בוא יבש 10 דקות. לשטוף 2 x במים מזוקקים במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (את השלבים הבאים, 6.1.5 – 6.1.13, מבוצעות בטמפרטורת החדר). הכתם בתמיסה של מאיר Hematoxylin עבור8 דקות. להתרחץ חמים (30 מעלות צלזיוס) מי ברז במשך 10 דקות. הזמנים משתנים מים שונים. יש לשטוף במים מזוקקים. יש לשטוף ב EtOH 95% עבור 20 שניות. Counterstain בפתרון G / Y Eosin עבור 40 שניות. מייבשים 2 x ב EtOH 95% עבור 5 דקות לכל הדגירה. מייבשים 2 x ב EtOH 100% עבור 5 דקות לכל הדגירה. ברור 2 x קסילן 5 דקות לכל סליקה. הר ב-Histokitt רוטי. 6.2. אימונוהיסטוכימיה בתצהיר קולגן אני: הכבד קציר, לטבול רקמות Tek אוקטובר בתבנית בסיס חד פעמי הקפאה מהירה על קרח יבש. חותכים 7 חלקים רקמות הכבד מיקרומטר באמצעות cryostat Leica נקבע -17 ° C ו הר בסעיפים רקמות על Superfrost פלוס שקופיות מיקרוסקופ. שקופיות חנות ב -20 ° C עד לשימוש נוסף. תקן cryosections ב EtOH קרים למשך 15 דקות ב -20 ° C. בוא יבש 10 דקות. לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר. <li> דגירה של PBS המכיל 0.3% H 2 O 2 ו -0.1% Na-אזיד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר. חסום עם ערכת avidin-ביוטין חסימת פי הנחיות היצרן. חסום עם FCS 10% PBS (FCS / PBS) למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הנוגדן העיקרי הוא אנטי העכבר ארנב קולגן נוגדנים אני אשר מדולל 1:200 ב 10% FCS / PBS. דגירה חלקים עם הנוגדן העיקרי 2 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את סעיפים 3 x ב PBS 4 דקות בטמפרטורת החדר. לדלל biotinylated נוגדנים נגד ארנב 1:500 ו דגירה עם קטעים של 1.5 שעות בטמפרטורת החדר. לשטוף את סעיפים 3 x ב PBS 4 דקות בטמפרטורת החדר. תגובת צבע מתקבל על ידי הדגירה רציף עם הצמוד avidin-peroxidase ו-diaminobenzidine מי חמצן על פי הנחיות היצרן. ב Counterstain של מאיר הואפתרון matoxylin 5 דקות, לשטוף 2 x ב PBS 2 דקות בטמפרטורת החדר לעלות ב Aquatex. 7. נציג תוצאות זיהום של עכברים עם Ad-2D6 המושרה בשני שלבים שונים של נזק לכבד. בימים הראשונים לאחר ההדבקה, הווירוס דלקת של הכבד גורמת לעלייה חדה של רמות aminotransferase בסרום, המשקפת את מותו hepatocyte 6. זה השלב הראשון, חריפה מתרחשת עצמאית הביטוי של hCYP2D6 והוא יכול להיות גם ציין לאחר ההדבקה בווירוס פקד ריק (Ad-Control) או וירוס לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (Ad-GFP). לעומת זאת, השלב השני הוא אוטואימונית בתיווך ותלויה ביטוי של מולקולה מפעילה hCYP2D6. שלב זה אוטואימונית מתרחשת בתוך 2-4 שבועות לאחר זיהום נמשכת כמה חודשים 6. <p class = "jove_content"> באיור 1. CYP2D6. מודל Wildtype FVB או C57BL / 6 עכברים מוזרקים עם שתי מנות של Ad-2D6 (תוך ורידי ו intraperitoneal). בתקופה של ריבית הכבד בדם נאספים ולהעריך נזק כבד היווצרות נוגדנים ספציפיים hCYP2D6 ותאי T. את התכונות הבאות אופייניות של הפטיטיס אוטואימונית מתמיד בפיתוח אחרי המודעות לזיהום-2D6 של wildtype FVB או C57BL / 6 עכברים במודל CYP2D6: ראשית, הכבד מראה מורפולוגיה שונה aberrantly. בפרט, את אונה של הכבד הם התמזגו, גושים hyperplasic מופיעים פזורים על פני הכבד כולו סיסטיק capsular מסיבית גלוי (איור 2). איור 2. מורפולוגיה הכבד. נזק אופייני Ad-2D6-Induced הכבד זוהה ליום 4 זיהום שלאחר השבוע. שים לב, את אונה של הכבד בודדים התמזגו (ראשי חץ). גושים Hyperplasic מופיעים פזורים על פני הכבד כולו (חיצים). זיהום adenovirus השליטה לא להביע hCYP2D6 אין כל השפעה על מורפולוגיה הכבד. חדירות הסלולר השנייה, מקיף ומתמשך מופיעים באזורים פרי-פורטל parenchymal של הכבדים של העכברים Ad-2D6-נגועים אך לא Ad-Control-הנגוע (איור 3 א). סיסטיק מפתחת בעיקר באזור subcapsular עם כמה חבילות קולגן בולטות לתוך parenchyma (איור 3 ב). איור 3. היסטולוגיה הכבד. H & E מכתים סעיף הכבד רקמות של עכברים נגועים FVB Control-Ad או Ad-2D6 ב 4 זיהום שלאחר שבוע. שים לב, חדירות משמעותיות של תאים mononuclear נמצאים רק מודעות למוצרי 2D6 עכברים נגועים (חיצים בודדים). החצים מצביעים על טריפל חדירות סלולריים גדולים יותר parenchyma הכבד גישור בין שטחים פורטל השכנות. ב ': ייצוג immunohistochemical של לייפת הכבד בשבוע 4 לאחר ההדבקה עם 2D6, מודעות או מודעות שליטה. הסעיפים כבד כבר מוכתם עבור קולגן באמצעות נוגדנים נגד קולגן אני. הערה שכבה כפולה של אופי קולגן מתחת הקפסולה הכבד (חצים משולשים) עם כמה חבילות בולטות לתוך parenchyma (חיצים בודדים) ואת הנוכחות של קבוצות גדולות של תאים שחדרו (ראשי חץ). שני קטעים מייצגים כבד מוצגים עבור כל תנאי. גודל ברים: 100μm. התכונה השלישית היא דור titers גבוהות של נוגדנים נגד CYP2D6, אשר יש סגוליות epitope דומה LKM-1 נוגדנים אנושיים 6,13. האחרונות, hCYP2D6 ספציפיים CD4 ו CD8 ותאי ה-T נוצרות בעיקר כי ביתם של הכבד. כאלה hCYP2D6 ספציפיים בתאי T ניתן לאתר על ידי גירוי עם immunodominant hCYP2D6 פפטידים מדידה בדיעבד של הביטוי IFNγ ידי מכתים ציטוקינים תאיים (ICCS) (איור 4). hCYP2D6 ספציפיים CD8 ותאי T הורגים Ad-2D6-נגועים בתאי היעד in vivo 12. באיור 4. hCYP2D6 ספציפית בתאי ה-T. ניתוח תזרים cytometric של hCYP2D6 ספציפית בתאי T. לימפוציטים הכבד היו מבודדים בשבוע 4 אחרי המודעות לזיהום-2D6 והיו מגורה עם או את CD4 או CD8 immunodominant hCYP2D6 epitope לילה. דור של IFNγ זוהה על ידי צביעה ציטוקינים תאיים ונותחו על ידי cytometry הזרימה באמצעות FACS קנטו II (BD Biosciences, היידלברג, גרמניה). אחוז hCYP2D6 ספציפיים CD4 ו CD8 ותאי מצוין.