CYP2D6の動物モデル：マウスにおける自己免疫性肝炎を誘導する方法

1。眼科洞に広告-2D6の静脈注射無菌条件下で、RPMIで5×10 9 PFU / mlの濃度には、Ad-2D6ウイルスストック溶液を希釈し、氷上で広告-2D6ウイルス溶液を保持します。 5×10 8 pfuの（静脈内、腹腔内）の2つの用量の注入は、FVB系統のマウスにおける自己免疫性肝炎の最も信頼性の高い成果につながることが実証されています。 麻酔チャンバー内のイソフルラン4％、マウスを麻酔。動物が麻酔であることを確認するために後肢をピンチします。 首の後ろでマウスを保持し、親指と中指で頭のたるんだ皮膚を締めます。このように、目が目に隣接する皮膚に牽引力によってわずかに突出している。 内側眼角（動物の鼻に近いまぶたの接合部）に垂直に針を置き、徐々に100μlの広告-2D6ウイルス溶液を注入します。それはあまりにも多くの圧力を適用しないことが重要です。これは、血管と気管の損傷を避けることができます。 徐々に流出を避けるために、まぶたを閉じるには、針を撤回することができる。 ウイルスソリューションは、鼻トラフを漏れないし、目はその初期位置に戻ってスライド場合注射はうまくいきました。 すぐに静脈注射後には、Ad-2D6ウイルスソリューションの2つ目の100μlの標準的な腹腔内注射を行います。 また、静脈注射は尾静脈を介して実行することができます。しかし、眼科洞を経由して注入が実行する方がはるかに簡単ですし、ウイルス液の損失を最小限に抑えることができます。それは、これらの2つの技術は同じ意味で、両方のルートが10も同様に有効であることを使用することができることが実証されている。 感染したマウスは、背を丸めて、副作用や食欲不振、体重減少、運動機能の喪失、新郎に障害が発生し、粗い毛のコートとしての苦しみや痛みの明らかな兆候、監視され外観と同様に、傷、または特定の領域（注射すなわちサイト）を振る、かむ、なめる。マウスはCYP2D6モデルの肝臓への大きな被害を表示しますが、マウスは健康に見えると苦しみ、痛みやストレスの兆候を示していない。それにもかかわらず、血清アミノトランスフェラーゼなどの重篤な肝障害の指標は、定期的に決定するか行った実験の一部です。 > 1000 U / Lの血清アミノトランスフェラーゼ値は慢性的にウイルス感染の直接の結果として表示されますが、べきではありません。血清アミノトランスフェラーゼ値は慢性的にマウスを屠殺されている1000 U / L（重大度の限界）を超えている場合。 2。マウスの目の出血麻酔チャンバー内のイソフルラン4％、マウスを麻酔。動物が麻酔であることを確認するために後肢をピンチします。 首の後ろでマウスを保持し、親指と中指で頭のたるんだ皮膚を締めます。このように、目がによって若干突出目に隣接する皮膚に牽引。 眼の下や内側の隅にキャピラリーチューブの先端を置き、優しく、しかし、しっかりと眼静脈洞に眼球と一緒に下落した。静脈の毛細血管が破裂し、その結果出血が眼窩を埋めます。 わずかに蓄積された血​​液がチューブに吸い込まれるように先端を解放するために毛細管を取り消すことができます。 十分な血液が収集されたときに、チューブを取り出し、まぶたが閉じられます。出血は静脈、複雑な時に正常な眼圧のチューブと再建の撤退時に停止します。 毛細管内の血液は、Microtainerチューブに移し、氷上で30分間インキュベートされています。 Microtainerチューブを4℃で2分間7500×gで遠心分離されてい上清を新しいチューブに移し、そして-80℃で保存されている血清℃に対応血清は、ELISAにより抗体価を決定するために使用することができます。インディカそのようなアラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT / GPT）とアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ASTは/ GOT）肝酵素の血清レベル、肝臓損傷のtorsは、ロシュ·ダイアグノスティックスから応じてテストストリップ（マンハイム、ドイツ）とReflotronプラスアナライザを用いて評価することができる（ロシュ·ダイアグノスティックス、マンハイム、ドイツ）。 また、採血は尾静脈を介して、または浅側頭静脈11を介して行うことができます。 3。マウス肝臓の血流 備考：この手順では、血リンパ球による孤立性肝リンパ球の汚染を避けるために重要です。 頸椎脱臼に続いてCO 2の致死量で、マウスを安楽死させる。 発泡スチロールのボード上の背中に敷設動物をマウントします。四肢を固定するために23 G針を使用しています。 潤いと70％EtOHでマウスを駆除離れて後足から約1cmを通して切開を作る皮膚と筋層。横隔膜まで働く動物の両側にカットします。 ダイアフラムに達したときにスキンが後方に反転することができます。 下大静脈を切断して離れてリッピングから横隔膜をカットします。 門脈を露出し、オフ側に胃や腸に移動します。 門脈に冷PBSを充填した5mlの注射器に接続されている27 Gの針を挿入します。 PBSは徐々に肝臓から血を洗い流しましょう​​。 ダイアフラムにつかみ、体から離れて横隔膜を切断することによって肝臓を解剖。 ペトリ皿に肝臓を転送し、横隔膜、胆嚢、まだ肝臓に接続されている他の組織を除去する氷上で50 mlチューブに10 mlのPBSに肝臓を転送したり、OCTコンパウンドに埋め込むことができます。 4。肝リンパ球の分離以下のストック溶液を準備します。 コラゲナーゼIV株式 （100 mg / ml）をInのPBS。 （-20℃で小分けとストアを行います）。 PBS中のDNase株式 （25 mg / ml）を。 （-20℃で小分けとストアを行います）。 コラゲナーゼ緩衝液 ：PBS、0.2 mg / mlのコラゲナーゼIV、0.02 mg / mlのDNaseおよび5％FCSを含む、1肝 ​​臓のためには、9.5 mlの氷冷PBS、20μlのコラゲナーゼIV（100 mg / mlストック）、8μlのDNaseを（ミックス25 mg / mlストック）、および500μlの熱不活化FCS。 35％のパーコール 、ミックス175ミリリットルパーコール、20ミリリットル×10 PBS株式305 mlのPBS。 RPMI 完全 = RPMI、10％熱不活化FCS、100μ/ mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、2mMのL-グルタミンを含有する。 氷の上でペトリ皿に新鮮なPBSの10mlに灌流肝臓を（セクション3を参照）転送し、はさみを使用して小片に切断。 ガラスの乳棒または2 mlのシリンジから乳棒とを介して70μmのセルストレーナーおよびsqueezeの肝臓ジャンクに転送します。慎重に10ミリリットル冷コラゲナーゼバッファを追加して、ストレーナーを通して押してください。ストレーナーを介してサスペンションとフィルタの2倍以上を収集します。 氷の上で新鮮な50 mlチューブに懸濁液を移す。次に肝臓を処理します。 60分間37℃で肝細胞懸濁液をインキュベートし、15分毎に静かに混ぜる。 4℃で3分間、30×gで遠心ペレット上に5​​mmの液体を残して、新しいチューブに上清を移す 4℃で10分間650×gで遠心分離ペレット上記3ミリメートルを残し、上清を捨て 20ミリリットルパーコールバッファ内のペレットを再懸濁し 4℃で20分間600×gで遠心分離チューブをフリックで上清とペレットを廃棄してください。 PBSでペレットを1×洗浄します。 完全 RPMIでペレット1×を洗う 3ミリリットルRPMIで再懸濁し、ペレットを完了し、1:10希釈で細胞をカウントします。 RPMIで〜10 7細胞/ mlで再懸濁し、細胞が完了すると氷にチューブを転送します。 </ol> 5。細胞内サイトカイン染色（ICCS） 5.1刺激： 説明したように完全 RPMI中で〜10 7細胞/ mlで、肝リンパ球を準備します。プレートに100μl（10 6細胞）/ウェル組織培養処理されていない平らな96ウェルプレートに。 50μlのRPMI 完全に含んで2μg/mlブレフェルジンを追加した後、50μlのRPMIがCYP2D6ペプチド（すなわち、免疫CD4エピトープCYP2D6 41から60 PGLGNLLHVD FQNTPYCFDQ 12または免疫CD8エピトープCYP2D6 193から212 RRFEYDDPRF LRLLDLAQEG 12）刺激を含む2μg/ mlを完了する追加します。ピペッティングにより混和する。 37°C（最適刺激時間が一晩のインキュベーションも同様に動作します）で5時間インキュベートする。 5.2。染色： 以下のストック溶液を準備します。 FACS緩衝液 ：PBS、1％ウシ胎児sを含むerum（FCS）。 固定/透過処理バッファー：0.1％サポニンと4％パラホルムアルデヒドを含むFACS緩衝液 FACS /サポニンの洗浄緩衝液 ：0.1％サポニンを含むFACS緩衝液 FACS / PFAバッファ ：FACS緩衝液を含む1％パラホルムアルデヒド（PFA） V底マイクロタイタープレート（96ウェル）に細胞を移し、4℃で3分間460×gでスピン℃、媒体と渦プレートを捨てる 4℃で3分間460×gで℃にて150μlのFACS緩衝液、遠心分離を追加します。媒体と渦プレートを破棄します。ステップを洗うを繰り返します。 4℃15分間FACS緩衝液で1μg/ mlのαCD16/32カクテル（FCRブロック）と（二次抗体を使用している場合）、必要に応じてブロック表面のFcRは、°Cと150μlの染色液（で2分間460×gで2×を洗う4°C）。 表面分子の染色：4℃で30分間、暗所でCの50μlのFACS緩衝液すなわち抗CD8a-FITCモノクローナル抗体10μg/ mlの。 100μlのFACSを追加します。4℃で3分間460×gでバッファやスピン 150μlのFACS緩衝液（; 3分、4°C 460×g）での細胞2×洗浄します。渦のプレート。 RTで10分間、100μlの固定/透過バッファーで細胞を透過性/修正してください。 4℃で7分間460×gで遠心固定/ permeabilzationステップは、細胞の全体的な密度を変更しますので、7分に遠心時間を延長することが重要であることに注意してください。渦のプレート。 150μlのFACS /サポニンの洗浄バッファー（; 7分、4°C 460 XG）と2×を洗ってください。渦のプレート。 細胞内分子を染色：すなわち抗IFNγ-PE mAbを4℃で30分間50μlのFACS /サポニンの洗浄緩衝液で10μg/ mlの℃の 100μlのFACS / 4で7分間460×gで℃でサポニン洗浄バッファー、スピンを追加します。 150μlのFACS /サポニンの洗浄バッファー（; 7分、4°C 460×g）での細胞2×洗浄します。渦のプレート。 細胞をFACS緩衝液で1×を（; 7分、4°C 460×g）で洗浄します。渦のプレート。 </lI> 200μlのFACS / 4でPFAバッファ、チューブへの転送、およびストア°暗闇の中でCに再懸濁し、フローサイトメトリーによるデータの取得まで。我々は通常、FACSCanto IIまたはFACSキャリバー（BD Biosciences社、ハイデルベルク、ドイツ）を使用します。 6。免疫組織化学 6.1。一般的な肝臓の病理学の評価のためのH＆E染色： 収穫肝臓、ドライアイス上に使い捨ての基本型と迅速な凍結でティッシュ-Tek社は、OCTで浸す。 -17に設定ライカクリオスタットを使用して7μmの肝臓組織切片をカット℃、Superfrostプラス顕微鏡スライド上の組織切片をマウントします。 -20ストアスライド°C、さらに使用するまで。 -20℃で15分間プレ冷却エタノールで切片を修正しました。 10分間乾燥させます。 室温で2分間蒸留水で2×（ – 6.1.13、室温で行われ、次の手順、6.1.5）洗浄します。 のためマイヤーのヘマトキシリン​​液で染色8分。 10分間、暖かい（30℃）の水道水で洗ってください。水で数回変更し​​てください。 蒸留水ですすいでください。 20秒、95％エタノールでリンス。 40秒のためにエオシンG / Y溶液で対比。 インキュベーション当たり5分間、95％エタノールで2×を脱水。 インキュベーション当たり5分間、100％エタノールで2×を脱水。 クリアごとに5分間キシレン×2でクリア。 ロティ·Histokittにマウントします。 6.2。 I型コラーゲン沈着の免疫組織化学： 収穫肝臓、ティッシュ-Tek社は、OCTで浸す。ドライアイス上に使い捨ての基本型と迅速な凍結インチ -17に設定ライカクリオスタットを使用して7μmの肝臓組織切片をカット℃、Superfrostプラス顕微鏡スライド上の組織切片をマウントします。 -20ストアスライド°C、さらに使用するまで。 -20℃で15分間冷EtOHで凍結切片を修正しました。 10分間乾燥させます。 室温で2分間PBSで2×を洗ってください。 <LI>インキュベートしPBSに0.3％H 2 O 2、室温で10分間、0.1％のNa-アジドを含む。 室温で2分間PBSで2×を洗ってください。 製造元のガイドラインに従って、アビジン – ビオチンブロッキングキットを用いてブロック。 室温で30分間、PBS中10％FCS（FCS / PBS）を持つブロック。 一次抗体は、10％FCS / PBSで1:200に希釈されたウサギ抗マウスI型コラーゲン抗体である。室温で2時間一次抗体を持つセクションをインキュベートします。 室温で4分間のセクションをPBSで3×洗浄します。 1:500にビオチン化抗ウサギ抗体を希釈し、室温で1.5時間のセクションでインキュベートする。 室温で4分間のセクションをPBSで3×洗浄します。 呈色反応は、アビジン – ペルオキシダーゼ複合体と、製造元のガイドラインに従ってジアミノベンジジン – 過酸化水素を順次インキュベーションすることによって得られる。 マイヤーの彼の対比5分間matoxylinソリューションは、室温で2分間PBSで2×を洗ってAquatexにマウントします。 7。代表的な結果肝臓の損傷の広告-2D6誘導2つの異なるステージでのマウスの感染症。感染後の最初の日で、肝臓のウイルス感染は、血清アミノトランスフェラーゼ値の急激な増加、肝細胞死の6指標を引き起こします。この最初の、急性期はhCYP2D6の発現の独立した発生し、また、空のコントロールウイルス（AD-コントロール）や緑色蛍光タンパク質（AD-GFP）を発現するウイルス感染後に観察することができます。対照的に、第二段階は、自己免疫介在性とトリガ分子hCYP2D6の発現に依存しています。この自己免疫段階は2-4週間後に感染症の中で発生し、数ヶ月6に保持されます。 <Pクラス= "jove_content"> 図1。 CYP2D6モデル。野生型FVBまたはC57BL / 6マウスは、Ad-2D6の2つの用量（静脈内、腹腔内）を注射されています。興味のある時に肝臓や血清、肝臓の損傷やhCYP2D6特異的抗体およびT細胞の形成のために収集され、評価されています。 以下の機能が野生型FVBまたはC57BL / CYP2D6モデルで6匹のマウスの広告-2D6-感染後の永続的な発展自己免疫性肝炎の特性は次のとおりです。まず、肝臓が異常に変更形態を示しています。特に、肝臓ローブが融合され、過形成結節が肝臓全体に散在し、大規模な莢膜線維が表示されている（図2）が表示されます。 図2。肝臓の形態。典型的な広告-2D6誘発性肝障害4週後に感染症で検出された。個々の肝葉が（矢頭）に融合されることに注意してください。過形成結節が肝臓全体（矢印）に散らばって表示されます。 hCYP2D6を発現していないコントロールのアデノウイルス感染は、肝臓の形態に影響を与えません。 第二に、広範かつ永続的な細胞の浸潤は、Ad-Controlの感染マウス（図3a）AD-2D6感染はなく、肝臓の周囲のポータルと実質地域で表示されます。線維症は、主に実質（図3B）に突出するいくつかのコラーゲンの束で嚢下領域で開発しています。 図3。肝臓組織：4週後に感染症でAd-Controlまたは広告-2D6のいずれかで感染したFVBマウスの肝臓組織切片のH＆E染色。単核細胞の有意な浸潤が（AD-2D6感染マウスにのみ存在していることに注意してください単一の矢印）。三重の矢印は、隣接する門脈の間のブリッジングの肝実質の大きい携帯電話浸潤を示しています。 B：AD-2D6またはAd-制御と感染後4週での肝線維症の免疫組織化学的表現。肝臓切片は、抗I型コラーゲン抗体を用いたコラーゲンのために染色されています。実質（単一の矢印）と浸潤細胞の大規模なクラスタ（矢頭）の存在下に突き出たいくつかのバンドルで肝臓のカプセル（トリプル矢印）の下にコラーゲン処分複数のレイヤーに注意してください。二つの代表的な肝臓のセクションは各条件ごとに表示されます。サイズバー：100μmの。 第三の特徴は、人間のLKM-1抗体は6,13と同様のエピトープ特異性を有する抗CYP2D6抗体の高力価の世代です。最後に、hCYP2D6-特異的CD4およびCD8 T細胞は肝臓に家その主に生成されます。このようなhCYP2D6特異的T細胞がimmunodomiで刺激することによって検出することができますNAntのhCYP2D6ペプチドおよび細胞内サイトカイン染色（ICCS）（図4）によるIFNγの発現の事後測定。 hCYP2D6特異的CD8 T細胞は、 生体 12 に広告-2D6感染標的細胞を殺す。 図4。 hCYP2D6特異的T細胞。hCYP2D6特異的T細胞のフローサイトメトリー分析。肝リンパ球は、Ad-2D6-感染後4週で分離されており、免疫CD4またはCD8一晩hCYP2D6エピトープのいずれかで刺激した。 IFNγの生成は、細胞内サイトカイン染色によって検出し、FACSカントII（BD Biosciences社、ハイデルベルク、ドイツ）を用いてフローサイトメトリーによって分析した。 hCYP2D6-特異的CD4およびCD8細​​胞の割合が示されています。