Summary

Isolamento e Cultura de neurônios do hipocampo de ratos pré-natal

Published: July 26, 2012
doi:

Summary

Nós fornecer um protocolo para a cultura de neurónios do hipocampo altamente purificado a partir de cérebros de rato pré-natal, sem a utilização de uma camada de células alimentador glial.

Abstract

As culturas primárias de rato e murina neurónios do hipocampo são amplamente utilizados para revelar os mecanismos celulares em neurobiologia. Com o isolamento e crescente neurónios individuais, os pesquisadores são capazes de analisar as propriedades relacionadas com o tráfico celular, a estrutura celular e localização de proteínas individuais usando uma variedade de técnicas bioquímicas. Os resultados de tais experiências são fundamentais para testar as teorias que abordam a base neural da memória e aprendizagem. No entanto, a partir de resultados inequívocos estas formas de experiências são baseadas na capacidade de crescer culturas neuronais com a contaminação mínima por outros tipos de células cerebrais. Neste protocolo, usamos meios específicos projetados para o crescimento dos neurônios e dissecção cuidadosa do tecido hipocampal embrionário para otimizar o crescimento de neurônios saudáveis, minimizando os tipos de células contaminantes (astrócitos, por exemplo). Tecido embrionário de rato do hipocampo pode ser mais difícil de isolar do que o tecido roedor semelhante, devido ao tamanho da amostra para o dissection. Mostramos técnicas de dissecação detalhadas de hipocampo de ratos filhotes embrionárias dia 19 (E19). Uma vez que o tecido do hipocampo é isolado, a dissociação suave de células neuronais é conseguido com uma concentração diluída de tripsina e ruptura mecânica concebido para separar células de tecido conjuntivo, proporcionando mínimo de danos para as células individuais. Uma descrição detalhada de como preparar pipetas para ser utilizado na ruptura é incluído. Densidades de revestimento ideais são fornecidas de imuno-fluorescência protocolos para maximizar a cultura de células de sucesso. O protocolo fornece uma técnica rápida (cerca de 2 horas) e eficiente para a cultura de células neuronais do hipocampo do rato a partir de tecido.

Protocol

1. Set-up antes da colheita Para gerar filhotes de pré-natal para a colheita neurônio, agendar cruzamento entre camundongos adultos de 19 dias antes do dia de isolamento do neurônio. (C57BL / 6 idades de 2-8 meses, foram usados ​​em acasalamentos para efeitos de desenvolver este protocolo). Acasalamento bem sucedida pode ser confirmado por detecção de um rolhão vaginal na confirmação palpitação, fêmea ou visual da gravidez. O dia antes do isolamento do neurônio: <ol class="u…

Discussion

Culturas de hipocampo têm sido utilizados em biologia molecular para mais de 20 anos. Embora, em princípio, culturas neuronais pode ser feito de qualquer parte do cérebro, as culturas de hipocampo provaram ser os mais populares devido à arquitectura relativamente simples da população de células nervosas no hipocampo 7. Culturas do hipocampo são normalmente feitas de fase final de tecido embrionário. Este tecido é mais fácil para dissociar e contém menos células gliais do que o faz o tecido cerebr…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos ao Dr. Michael Wooten por sua ajuda na preparação do manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo NIH 2RO1NS033661 (MWW).

Materials

Name of Reagent Vendor Catalog Number
Rat Tail Collagen 1 BD Biosciences 354236
Poly-D-lysine Solution Chemicon A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution Invitrogen 14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid Invitrogen 15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid Invitrogen 21103-049
B27 Supplement (50X) liquid Invitrogen 17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid Invitrogen 25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) Invitrogen 15140-148
HI-Donor Horse Serum Atlanta Biologicals S12150H

Riferimenti

  1. Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
  2. Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
  3. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
  4. Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
  5. Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
  6. Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
  7. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  8. Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
  9. Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
  10. Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
  11. Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
  12. Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
  13. Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
  14. Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).

Play Video

Citazione di questo articolo
Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice. J. Vis. Exp. (65), e3634, doi:10.3791/3634 (2012).

View Video