L'isolement et la culture de neurones de l'hippocampe de souris pendant la grossesse
Summary
Nous fournissons un protocole pour la culture de neurones de l'hippocampe hautement purifiée à partir de cerveaux de souris prénatales sans l'utilisation d'une couche de cellules nourricières gliales.
Abstract
Les cultures primaires de rat et de souris neurones de l'hippocampe sont largement utilisés pour révéler les mécanismes cellulaires de la neurobiologie. En isolant et en pleine croissance des neurones individuels, les chercheurs sont capables d'analyser les propriétés liées à la traite cellulaire, structure cellulaire et la localisation des protéines individuelles en utilisant une variété de techniques biochimiques. Les résultats de ces expériences sont essentiels pour tester les théories portant sur les bases neurales de la mémoire et l'apprentissage. Cependant, des résultats sans ambiguïté de ces formes d'expériences sont fondées sur la capacité de croître des cultures de neurones à la contamination minimale par d'autres types de cellules du cerveau. Dans ce protocole, nous utilisons des supports spécifiques conçus pour la croissance des neurones et une dissection minutieuse du tissu hippocampique embryonnaire pour optimiser la croissance des neurones sains tout en minimisant les types de cellules contaminantes (astrocytes par exemple). Embryonnaire de la souris tissu hippocampique peut être plus difficile d'isoler que les tissus des rongeurs similaire en raison de la taille de l'échantillon pour dissection. Nous montrons les techniques de dissection détaillée de l'hippocampe à partir embryonnaires souriceaux jour 19 (E19). Une fois le tissu hippocampique est isolée, la dissociation des cellules neuronales douce est obtenue avec une concentration diluée de la trypsine et la rupture mécanique des cellules destiné à séparer les tissus conjonctifs tout en fournissant un minimum de dégâts à des cellules individuelles. Une description détaillée de la façon de préparer les pipettes à être utilisé dans la perturbation est inclus. Densités optimales de placage sont prévus pour l'immuno-fluorescence protocoles afin de maximiser la culture de cellules avec succès. Le protocole prévoit une technique rapide (environ 2 h) et efficace pour la culture des cellules neuronales à partir de tissus de la souris hippocampe.
Protocol
Discussion
Cultures hippocampe ont été utilisés en biologie moléculaire pour plus de 20 ans. Bien qu'en principe, les cultures de neurones peuvent être fabriqués à partir de n'importe quelle partie du cerveau, l'hippocampe cultures se sont révélées être les plus populaires en raison de l'architecture relativement simple de la population de cellules nerveuses dans l'hippocampe 7. Cultures d'hippocampe sont généralement fabriqués à partir de tard-étape tissu embryonnaire. Ce tissu e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Michael Wooten pour son aide dans la préparation du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le NIH 2RO1NS033661 (MWW).
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
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