Prenatal Fareler gelen Hipokampal Nöronlar izolasyonu ve Kültürü
Summary
Bu yüksek bir besleyici hücre glial tabakanın kullanımı olmaksızın prenatal fare beyinlerinden hipokampal nöronlar saflaştırılmış kültürü için bir protokolü sağlar.
Abstract
Sıçan ve fare hipokampal nöronların primer kültürlerinde yaygın nörobiyoloji hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için kullanılır. Bireysel nöronlar yalıtma ve büyüyerek, araştırmacılar hücresel kaçakçılığı, hücresel yapı ve biyokimyasal çeşitli teknikler kullanarak bireysel protein lokalizasyonu ile ilgili özelliklerini analiz edebiliyoruz. Bu tür deneylerin sonuçları, hafıza ve öğrenme nöral temelini ele teorileri test etmek için önemlidir. Ancak, deney Bu formlardan kesin sonuçlar diğer beyin hücre türlerine göre asgari kirlenme ile nöronal kültürlerin büyümeye yeteneği esas alınır. Bu protokol, biz kirletici hücre tipleri (yani astrositler) en aza indirerek sağlıklı nöronların büyüme optimize etmek embriyonik hipokampus doku nöron büyüme ve dikkatli diseksiyon için özel olarak tasarlanmış ortamları kullanın. Embriyonik fare hipokampus doku di için örnek boyutu nedeniyle benzer bir kemirgen doku daha izole etmek daha zor olabilirssection. Biz embriyonik günde 19 (E19) fare yavrularının gelen hipokampus ayrıntılı diseksiyon teknikleri gösteriyor. Bireysel hücre en az zarar sağlarken bir kez hipokampal doku izole edilir, nöronal hücre nazik ayrışma tripsin ve birleştirici dokudan ayrı hücreleri için tasarlanmış mekanik bir bozulma seyreltik konsantrasyonu ile elde edilir. Kesinti kullanılmak üzere pipet nasıl hazırlanacağını ayrıntılı bir açıklaması dahildir. Optimal kaplama yoğunlukları başarılı hücre kültürü üst düzeye çıkarmak için immuno-floresans protokoller için verilmektedir. Protokol fare hipokampal dokudan nöronal hücre kültürü için hızlı bir (yaklaşık 2 saat) ve verimli bir yöntem sağlar.
Protocol
Discussion
Hipokampal kültürleri 20 yıldan fazla için moleküler biyolojide kullanılan edilmiştir. Prensip olarak ise, nöronal kültürler beyin herhangi bir kısmı ile yapılabilir, hipokampal kültürler hipokampus 7'de sinir hücre nüfusun nispeten basit bir mimariye bağlı en popüler olduğu kanıtlanmıştır. Hipokampal kültürler genellikle geç dönem embriyonik dokudan yapılmıştır. Bu doku ayırmak kolaydır ve olgun beyin dokusu 1 oranla daha az glial hücreler içerir. Embriyoni…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu yazının hazırlanmasındaki yardımlarından dolayı Dr Michael Wooten teşekkür ederim. Bu çalışma NIH 2RO1NS033661 (MWW) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name of Reagent | Vendor | Catalog Number |
| Rat Tail Collagen 1 | BD Biosciences | 354236 |
| Poly-D-lysine Solution | Chemicon | A-003-E |
| Hanks Balanced Salt Solution | Invitrogen | 14175-095 |
| Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid | Invitrogen | 15050-065 |
| NeuroBasal Medium (1X) liquid | Invitrogen | 21103-049 |
| B27 Supplement (50X) liquid | Invitrogen | 17504-044 |
| L-Glutamine 200 mM (100X) liquid | Invitrogen | 25030-149 |
| Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml) | Invitrogen | 15140-148 |
| HI-Donor Horse Serum | Atlanta Biologicals | S12150H |
Riferimenti
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-442 (1977).
- Brewer, G. J. Serum-free B27/neurobasal medium supports differentiated growth of neurons from the striatum, substantia nigra, septum, cerebral cortex, cerebellum, and dentate gyrus. J. Neurosci. Res. 42, 674-683 (1995).
- Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71, 143-155 (1997).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J. Neurosci. Res. 35, 567-576 (1993).
- Burwell, R. D., Saddoris, M. P., Bucci, D. J., Wiig, K. A. Corticohippocampal contributions to spatial and contextual learning. J. Neurosci. 24, 3826-3836 (2004).
- Gluck, M. A., Myers, C., Meeter, M. Cortico-hippocampal interaction and adaptive stimulus representation: a neurocomputational theory of associative learning and memory. Neural Netw. 18, 1265-1279 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Mao, L., Wang, J. Q. Gliogenesis in the striatum of the adult rat: alteration in neural progenitor population after psychostimulant exposure. Brain Res. Dev. Brain Res. 130, 41-51 (2001).
- Mao, L., Wang, J. Q. Upregulation of preprodynorphin and preproenkephalin mRNA expression by selective activation of group I metabotropic glutamate receptors in characterized primary cultures of rat striatal neurons. Brain Res. Mol. Brain Res. 86, 125-137 (2001).
- Oorschot, D. E. Effect of fluorodeoxyuridine on neurons and non-neuronal cells in cerebral explants. Exp. Brain Res. 78, 132-138 (1989).
- Price, P. J., Brewer, G. J., Federoff, S., Richardson, A. Serum -free media for neural cell cultures. Protocols for Neural Cell Culture. , (2001).
- Shen, J., Watanabe, S., Kaneko, A. Cell dissociation with papain reduces the density of cGMP-activated channels of the retinal rod. Jpn. J. Physiol. 45, 151-164 (1995).
- Stratmann, G., Sall, J. W., May, L. D., Loepke, A. W., Lee, M. T. Beyond anesthetic properties: The effects of isoflurane on brain cell death, neurogenesis and long-term neurocognitive function. Anesthesia and Analgesia. 110, 431-437 (2009).
- Wallace, T. L., Johnson, E. M. Cytosine arabinoside kills postmitotic neurons: evidence that deoxycytidine may have a role in neuronal survival that is independent of DNA synthesis. J. Neurosci. 9, 115-124 (1989).
