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Neuroscienze

क्रेफ़िश लेग extensor बलवान पर उच्च और निम्न आउटपुट NMJs की शारीरिक रिकॉर्डिंग

Published: November 17, 2010
doi:
10.3791/2319
,
1Department of Biology,University of Kentucky

Summary

यह आलेख दर्शाता है कि कैसे extensor मांसपेशियों पर synaptic प्रतिक्रियाओं का electrophysiological रिकॉर्डिंग आचरण क्रेफ़िश के पैर चलने में और तंत्रिका टर्मिनलों कल्पना कैसे कर रहे हैं उच्च और कम उत्पादन तंत्रिका टर्मिनलों के सकल रूपात्मक मतभेद दिखाने.

Abstract

हम विस्तार कैसे बेनकाब और synaptic प्रतिक्रियाओं का electrophysiological रिकॉर्डिंग (phasic) उच्च और निम्न निर्गम (टॉनिक) मोटर न्यूरॉन्स क्रेफ़िश के पैर चलने में extensor मांसपेशियों innervating के लिए आचरण में समझाओ. फिजियोलॉजी और phasic और टॉनिक तंत्रिका टर्मिनलों की आकारिकी में स्पष्ट मतभेद मौजूद हैं. टॉनिक अक्षतंतु कई और अधिक mitochondria के होते हैं, यह लेने के लिए एक महत्वपूर्ण phasic अक्षतंतु से अधिक तीव्रता से दाग सक्षम है. टॉनिक टर्मिनलों varicosities है, और phasic टर्मिनल filiform है. टॉनिक टर्मिनलों synaptic प्रभावकारिता में कम हैं, लेकिन नाटकीय सुविधा प्रतिक्रियाओं को दिखाने के. इसके विपरीत, phasic टर्मिनलों quantal प्रभावकारिता में उच्च हैं, लेकिन उच्च आवृत्ति उत्तेजना के साथ synaptic अवसाद दिखाने के. quantal उत्पादन एक केन्द्र macropatch कल्पना तंत्रिका टर्मिनलों पर सीधे रखा इलेक्ट्रोड के साथ मापा जाता है. दोनों phasic और टॉनिक टर्मिनलों ही मांसपेशी फाइबर, जो कि न्यूरॉन्स में निहित मतभेद, बजाय morphological और शारीरिक भेदभाव के लिए अंतर पेशी से प्रतिगामी प्रतिक्रिया, खाते पता चलता है अंदर आना.

Protocol

1) परिचय मोटर न्यूरॉन्स synapses है जो सामूहिक रूप से एक neuromuscular जंक्शन (NMJ) के रूप में संदर्भित कर रहे हैं पर एक मांसपेशी फाइबर के साथ संवाद. NMJs सबसे क्रेफ़िश मांसपेशियों की तैयारी में आसानी से पहुँचा जा सकता है. क्रेफ़िश NMJs के कई गैर spiking उत्तेजक postsynaptic (EPSP) क्षमता वर्गीकृत बिजली स्तनधारी CNS या subthreshold हड्डीवाला NMJs में विख्यात प्रतिक्रियाओं के भीतर postsynaptic dendrites में उत्पन्न संकेतों के लिए इसी तरह की दिखाना (Wiersma और वान Harreveld, 1938, Katz और Kuffler, 1946) . क्रेफ़िश NMJs मौलिक synaptic मॉडल के रूप में सेवा करने के लिए synaptic प्रसारण और synaptic भेदभाव में सामान्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं. आम तौर पर, मोटर इकाइयों NMJs और मांसपेशियों के गुणों को synaptic संचार के प्रकार के माध्यम से पशुओं के व्यवहार के पहलुओं को विनियमित. "तेजी" और "धीमी" केकड़ा और करीब मांसपेशियों क्रेफ़िश (लुकास, 1907, 1917) में मांसपेशी संकुचन की पहली टिप्पणी के बाद से, इसी तरह की पेशी सिकुड़ा भेदभाव जैसे पेट flexors (कैनेडी और Takeda, 1965a अन्य क्रेफ़िश मांसपेशी प्रकार में वर्णित किया गया है , ख) और अंग extensors (वान Harreveld और Wiersma, 1936). "फास्ट" संकुचन त्वरित प्रतिक्रिया आरंभ करें. उदाहरण के लिए, क्रेफ़िश पूंछ फ्लिप एक तेजी से व्यवहार है. "धीरे" संकुचन धीमी गति को बनाए रखने और मुद्रा (Bradacs एट अल., 1997) बनाए रखने में मदद. "तेजी" और "धीमी" मांसपेशी संकुचन करने के लिए इसी, "/ phasic उच्च उत्पादन" और "टॉनिक / कम उत्पादन" मोटे तौर पर मोटर न्यूरॉन्स का वर्णन किया जाता है. दर और मांसपेशी संकुचन के समय में अंतर synaptic संरचना और synaptic शक्ति में presynaptic मतभेद (राजा एट अल, 1996) से संबंधित हिस्से में है. Myofibrillar प्रोटीन isoform अभिव्यक्ति भी सिकुड़ा में अंतर महत्वपूर्ण है, लेकिन पैर extensor मांसपेशियों, जिसमें एक भी फाइबर मोटर न्यूरॉन्स के दोनों प्रकार के द्वारा innervated है कि तरह की तैयारी में टर्मिनलों के synaptic मतभेद पर ध्यान केंद्रित है, के बाद से टर्मिनलों शेयर एक ही लक्ष्य सेल (Mykles एट अल., 2002). पहले के एक अध्ययन दो पैर extensor के उत्तेजक मोटर axons की जांच की और phasic और टॉनिक phenotypes (Bradacs एट अल., 1997) में वर्णित है. इस रिपोर्ट में, हम का प्रदर्शन कैसे विच्छेदन प्रदर्शन करने के लिए और रिकॉर्डिंग प्राप्त इतना है कि दूसरों को आगे इन तंत्रिका टर्मिनलों के synaptic भेदभाव के गुणों की जांच कर सकते हैं. के साथ देखा संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और क्रेफ़िश पैर extensor मांसपेशियों पर टॉनिक और phasic टर्मिनल से प्राप्त वर्गों के विभिन्न श्रृंखला से पता चला है कि टॉनिक टर्मिनलों phasic टर्मिनलों से अधिक RRP vesicles होते, mitochondria टॉनिक न्यूरॉन्स में अधिक प्रचलित हैं, और phasic टर्मिनलों पर synapses कम उत्पादन synapses पर उन लोगों की तुलना में अधिक जटिल है, क्योंकि वे विभिन्न रिक्ति (मिलर एट अल, 2002; जॉनस्टोन एट अल, 2008, राजा एट अल, 1996;. Bradacs एट अल, 1997) के साथ कई सक्रिय क्षेत्र होते हैं . कम उत्पादन टॉनिक टर्मिनलों भी अधिक बढ़ाने neuromodulator serotonin के साथ synaptic प्रसारण (5 हिंदुस्तान टाइम्स) के लिए अतिसंवेदनशील से phasic टर्मिनलों (कूपर एट अल., 2003) हैं. तथ्य यह है कि टॉनिक और phasic NMJ ही मांसपेशी फाइबर पर मौजूद हैं यह आसान एक दिया मांसपेशी फाइबर पर presynaptic अंतर का आकलन करने के लिए और मांसपेशियों की थकान, synaptic अवसाद और synaptic पार बात के सवालों के पते बनाता है. विभिन्न सवालों के इस तैयारी में संबोधित जैसे कि क्या वहाँ postsynaptic रिसेप्टर और टॉनिक और phasic टर्मिनलों के लिए postsynaptic लक्ष्य में घनत्व ग्लूटामेट रिसेप्टर उपप्रकारों में मतभेद हैं, रहते हैं, लेकिन और इनमें से शरीर रचना विज्ञान और शरीर विज्ञान में मौलिक अंतर का एक बेहतर समझ दो मोटर इकाइयों एक और अधिक गहरा ज्ञान के आधार के निर्माण में सहायता करेगा. उम्मीद है कि इस synaptic तैयारी में सीखा मौलिक सिद्धांतों के विभिन्न तैयारी में अन्य synapses के लिए लागू हो सकता है और क्रेफ़िश के इस synaptic मॉडल में भविष्य जांच को बढ़ाने जाएगा. 2) तरीकों सभी प्रयोगों midsize क्रेफ़िश (Procambarus clarkii) के पहले या दूसरे चलने पैरों पर आयोजित की जाती हैं. जानवरों व्यक्तिगत oxygenized पानी के साथ प्लास्टिक के कंटेनर में रखे जाते हैं. जानवर कमरे के तापमान 13 डिग्री सेल्सियस 16 डिग्री सेल्सियस की रेंज में है जानवरों सूखी मछली खाना और पानी के एक साप्ताहिक आधार पर बदल के साथ खिलाया जाता है. चित्रा 1: एक पैर चलने क्रेफ़िश और छह दूरवर्ती क्षेत्रों के योजनाबद्ध. क्रेफ़िश में चलने पैर के बाहर का पहलू anatomically से छह खंडों (चित्रा 1) में बांटा गया है. पैर extensor meropodite में स्थित है, और तंत्रिका बंडल है कि अलग हो जाएगा meropodite ischiopodite संयुक्त करीब है. टॉनिक या phasic अक्षतंतु चुनिंदा n के रूप में प्रेरित किया जा सकता हैशारीरिक प्रयोजनों के लिए eeded बाद वे उजागर कर रहे हैं. कूपर और कूपर (2009) प्रारंभिक विच्छेदन के कुछ पहलुओं का वर्णन meropodite क्षेत्र के भीतर सलामी बल्लेबाज मोटर न्यूरॉन के excitor को उजागर करने के लिए तरीकों सहित, लेकिन उनके वर्णन नुकसान से extensor मांसपेशियों की रक्षा के लिए आवश्यक देखभाल प्रदान नहीं करता है, के रूप में यह था जरूरत नहीं सलामी बल्लेबाज मांसपेशियों तैयारी पता है. आदेश में extensor की रक्षा के लिए, पहली या दूसरी चलने पैर क्रेफ़िश से निकाल दिया जाता है, शरीर की लंबाई में 6-10 सेमी (Atchafalaya जैव आपूर्ति कं, Raceland, ला) को मापने जानवर उत्प्रेरण सशक्त बन्द रखो के साथ अंग automize, ischiopodite खंड में फ्रैक्चर विमान के लिए बाहर का है. पैर विच्छेदन की थाली पर (बाहरी पक्ष) पार्श्व दर्शक का सामना करना पड़ के साथ रखा गया है. पैर चारों ओर कर दिया है जब तक दर्शक यकीन है कि बाहर (पार्श्व की ओर) विच्छेदन प्लेट पर का सामना करना पड़ रहा है, धनुषाकार पक्ष के साथ आमतौर पर (चित्रा 2) किया जा सकता है. टिशू पेपर के एक टुकड़े पर पैर रखकर यह आसान तैयारी बारी जबकि इन कटौती करने के लिए बनाता है. चित्रा 2: meropodite के पार्श्व की ओर, आमतौर पर पक्ष है कि धनुषाकार है, विच्छेदन की थाली पर का सामना करना पड़ रहा है. एक स्केलपेल ब्लेड ब्रेकर और धारक के साथ, एक तेज धार meropodite खंड के लिए चित्रा 3 में दिखाया गया पैटर्न में बस के माध्यम से काटने तक खोदना छल्ली के लिए प्रयोग किया जाता है. केयर पृष्ठीय पर बहुत दूर नहीं डिस्टल meropodite – carpopodite संयुक्त द्वारा उदर में कटौती करने के लिए काट लिया जाता है. चित्रा 3: छल्ली की खिड़की नक़्क़ाशी के लिए एक पैटर्न के रूप में सुझाव दिया लाइनों के साथ meropodite खंड. तैयारी खारा में रखा गया है. विच्छेदन डिश के तल पर एक Sylgard (डॉव Corning) कोटिंग (1cm मोटी) Sylgard इतना प्रयोग किया जाता है कि कीट पिन तैयारी अभी भी आयोजित करने के लिए इसे में अटक जा सकता है. चाहिए. इस बिंदु पर, एक पिन carpopodite खंड के बीच में और ischiopodite खंड (चित्रा 4) के पृष्ठीय पहलू में अटक गया है. Dissected तैयारी मानक क्रेफ़िश खारा में स्नान कर रहे हैं, वान एस Harreveld (1936) समाधान है, जो 205 NaCl के साथ बनाया है से संशोधित; 5.3KCl; 13.5 2 CaCl, 2H 2 हे, 2.45 2 MgCl, 6 2 हे, 5 HEPES और करने के लिए समायोजित पीएच 7.4 (मिमी में). चित्रा 4: कटौती खिड़की के साथ meropodite खंड से उठाया जा रहा है . विच्छेदन पिन के स्थान नोट. छल्ली धीरे बाहर का क्षेत्र में उठाया है और मांसपेशी फाइबर छल्ली से दूर पैर के आधार की ओर स्ट्रोक बनाने से काट रहे हैं. छल्ली बंद उठाया जा सकता है. apodeme (कण्डरा) meropodite – carpopodite संयुक्त काट रहा है. एक पिन flexor कण्डरा की भीतरी सतह को दिखाने के लिए जहां कट (चित्रा 5) बनाया जा रहा है पर रखा गया है. कण्डरा तो है pinched जहां यह चिमटी और यह एक दुम दिशा (चित्रा 6) में उठाने, मुख्य पैर तंत्रिका और extensor मांसपेशियों को उजागर करके दूर खींच लिया flexor मांसपेशियों के साथ काट दिया गया. चित्रा 5: flexor मांसपेशियों के apodeme यह एक पिन के साथ flexor से displacing द्वारा प्रकाश डाला है. चित्रा 6: flexor मांसपेशियों के apodeme में कटौती करने के लिए और देखभाल के साथ हटा के रूप में मुख्य पैर तंत्रिका क्षति के लिए नहीं. मुख्य पैर तंत्रिका meropodite – carpopodite संयुक्त में कट जाता है और ध्यान से extensor मांसपेशियों पर वापस खींच लिया. पेशी के औसत दर्जे का इस अध्ययन सतह भर में प्रयोग किया जाता है. तंत्रिका के मुख्य पैर तंत्रिका से extensor मांसपेशियों को जुदाई धीरे तैयारी के पक्ष में मुख्य पैर तंत्रिका के बाहर स्टंप खींच द्वारा बढ़ाया जा सकता है है. जब extensor मांसपेशियों से अधिक मुख्य पैर तंत्रिका वापस छीलने, अक्षतंतु की छोटी शाखाओं को काटा जा आवश्यकता हो सकती है. निरोधात्मक मोटर न्यूरॉन से extensor मांसपेशियों को शाखाएं हैं. बड़ा meropodite के प्रॉक्सिमल अंत के पास मुख्य पैर तंत्रिका से शाखाओं में बंटी बंडल ब्याज के छोटे तंत्रिका बंडल है. चित्रा 7: मुख्य पैर तंत्रिका कटौती की है और एक प्रॉक्सिमल दिशा में वापस खींच लिया . यह तंत्रिका बंडल methylene नीले रंग धुंधला हो जाना (8 चित्रा) के साथ या के साथ देखा जा सकता है है 4 – डि-2-एएसपी फ्लोरोसेंट दाग (9 चित्रा). 8 चित्रा: methylene नीले रंग के साथ extensor मांसपेशियों दाग. नोट अक्षतंतु शाखाओं में बंटी और तंत्रिका के भीतर दो आसानी से दिखाई axons. लाल तीर तंत्रिका ट्रैक Demark. <br/> 9 चित्रा: 4-डि-2-एएसपी के साथ मोटर तंत्रिका दाग के axons . टॉनिक अक्षतंतु अधिक चमकीले कारण बढ़ mitochondrial सामग्री दिखाई है. चित्रा 10A: 4-डि-2-एएसपी के साथ phasic और टॉनिक दाग न्यूरॉन्स की व्यक्तिगत टर्मिनलों . टॉनिक टर्मिनलों और phasic टर्मिनलों की पतली प्रकृति पर varicosities नोट. चित्रा 10B – टॉनिक ने कहा 10C-phasic चित्रा ने कहा 3) शारीरिक प्रोफ़ाइल टॉनिक या phasic न्यूरॉन्स के उत्तेजक postsynaptic क्षमता (EPSPs) का पालन करने के लिए, एक तंत्रिका बंडल में पृथक axons की एक चूषण (11 चित्रा) इलेक्ट्रोड एक ग्रास उत्तेजक औधधि से जुड़े द्वारा प्रेरित है, जबकि मांसपेशियों में intracellular क्षमता की निगरानी कर रहे हैं (जॉनस्टोन अल एट, 2008). 70 हर्ट्ज पर उत्तेजना टॉनिक अक्षतंतु लागू किया जाता है क्रम में कम उत्पादन NMJs के लिए एक सुविधा प्रतिक्रिया को बढ़ावा देने, या एक भी नाड़ी (1 हर्ट्ज) phasic अक्षतंतु के लिए लागू किया जाता है क्रम में करने के लिए उच्च उत्पादन की बड़ी EPSPs प्राप्त NMJs के रूप में दिखाया गया 12 चित्र में. EPSPs एक PowerLab/4s अंतरफलक के माध्यम से एक कंप्यूटर करने के लिए रिकॉर्ड कर रहे हैं. चित्र: 11 उत्तेजक तंत्रिका बंडल के भीतर एक ही अक्षतंतु पर रखा इलेक्ट्रोड. हरी लाइन 2 मुख्य axons रूपरेखा नोट. चित्र: 12 टॉनिक या phasic न्यूरॉन्स के रूप में intracellular रिकॉर्डिंग द्वारा प्राप्त की postsynaptic क्षमता (EPSPs ). Synaptic सुविधा और synaptic अवसाद की प्रकृति में जांच निम्न और उच्च उत्पादन NMJs के साथ विभिन्न प्रयोगात्मक मानदंड के द्वारा संपर्क किया जा सकता है. कम उत्पादन NMJs की सुविधा आवृत्ति पर निर्भर करता है, के रूप में लगभग 20 उत्तेजनाओं (13 चित्रा) के 20, 40 और 60 हर्ट्ज दालों के लिए दिखाया गया है. 13 चित्र: उत्तेजना तीन अलग आवृत्तियों 20, 40 और सामान्य क्रेफ़िश खारा में 60 हर्ट्ज पर दिया दालों की एक ट्रेन के जवाब में EPSPs. synaptic अवसाद की उत्तेजना की आवृत्ति दर उच्च उत्पादन NMJs के लिए भी संबंधित है. चित्रा 14 उत्तेजना के एक सतत 5 हर्ट्ज 30 मिनट से अधिक निराशाजनक NMJ से पता चलता है. उच्च उत्तेजना आवृत्ति के साथ, तैयारी और अधिक तेजी से दबाना (Bradacs एट अल., 1997) . चित्रा 14: EPSP आयाम phasic प्रतिक्रिया के 5 हर्ट्ज अवसाद प्रेरित उत्तेजना के दौरान . 4) Quantal प्रतिक्रियाएँ एक क्रेफ़िश (कूपर और कूपर, 2009) के सलामी बल्लेबाज पेशी के लिए वर्णित है कि करने के लिए इसी तरह की प्रक्रिया इस तैयारी में प्रयोग किया जाता है. तंत्रिका टर्मिनल के पहचान क्षेत्रों पर सीधे quantal EPSPs एक मैक्रो – पैच synaptic varicosities पर रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लुमेन रखकर दर्ज कर रहे हैं महत्वपूर्ण डाई 4-डि – 2 – Asp (5 सुक्ष्ममापी, 5 मिनट उपचार, कूपर एट साथ कल्पना अल, 1995; Magrassi एट अल, 1987).. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से सहज पैदा quantal प्रतिक्रियाओं तंत्रिका टर्मिनलों के साथ दर्ज किया जा सकता है. पैदा की और सहज synaptic क्षमता मैक्रो – पैच इलेक्ट्रोड (Dudel, 1981, Wojtowicz एट अल, 1991; Mallart, 1993) के साथ दर्ज हैं . Kimax ग्लास (बाहरी व्यास: 1.5 मिमी) खींच लिया और अंदर 10 से 20 सुक्ष्ममापी (15 चित्रा) को लेकर diameters के साथ पैच सुझावों का उत्पादन आग पॉलिश. चित्र: 15 मैक्रो पैच एक रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड के लुमेन. इलेक्ट्रोड के लुमेन स्नान मध्यम से भरा है. प्रवर्धक intracellular उपर्युक्त रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में ही है. इलेक्ट्रोड और सील प्रतिरोध इलेक्ट्रोड के माध्यम से गुजर परीक्षण वर्तमान दालों के द्वारा निर्धारित किया जा सकता है है. हमारे प्रयोगों में, सील resistances 0.3 से 1.0 MOhm लेकर और इलेक्ट्रोड प्रतिरोध में 0.5 से 1.0 MOhm करने के लिए लेकर. सील प्रतिरोध रिकॉर्डिंग के दौरान निगरानी किया जा सकता है. Quantal घटनाओं की प्रत्यक्ष गिनती कम उत्तेजना आवृत्तियों के साथ संभव है. प्रत्येक पैदा प्रतिक्रिया के लिए, quantal घटनाओं की संख्या आसानी से कम उत्पादन टर्मिनल (16 चित्रा) के लिए निर्धारित किया जा सकता है. इन प्रत्यक्ष मायने रखता है मतलब quantal सामग्री (; कूपर एट अल, 1995 डेल Castillo और Katz, 1954) का अनुमान करने में मदद कर सकते हैं. के बाद से पैदा की उच्च उत्पादन NMJs बहु quantal पैदा घटनाओं, मतलब आयाम या deflections के क्षेत्र औसत चोटी या सहज घटनाओं के आयाम क्षेत्र के साथ, उत्पादन, appro करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैमतलब quantal सामग्री (कूपर एट अल, 1995) ximate. चित्रा 16 फोकल निशान एक phasic और एक टॉनिक NMJ से दर्ज की गई. 17 चित्रा

Discussion

हम इस रिपोर्ट में प्रदर्शन किया है कैसे काटना रिकॉर्ड, और एक अद्वितीय क्रेफ़िश neuromuscular तैयारी है जो में दोनों उच्च और कम उत्पादन टर्मिनलों एक ही मांसपेशी फाइबर अंदर आना में synaptic प्रतिक्रियाओं यों. क्रेफ़िश में neuromuscular तैयारी हड्डीवाला neuromuscular जंक्शनों पर कई फायदे की पेशकश के बाद से केवल कुछ उत्तेजक मोटर न्यूरॉन्स के एक मांसपेशी अंदर आना की जरूरत है, और के बाद से न्यूरॉन्स तैयारी से तैयारी (Atwood, 1976) के लिए पहचाने जाने योग्य हैं. इसके अलावा, उत्तेजक neurotransmitter ग्लूटामेट है, और उत्तेजक postsynaptic क्षमता (EPSP) वर्गीकृत कर रहे हैं, इस प्रकार, वर्गीकृत घटनाओं की biophysical गुण रीढ़ की CNS के भीतर न्यूरॉन्स की dendrites के अनुरूप हैं. quantal धाराओं, तथापि, postsynaptic साइटों (कूपर एट अल, 1995) पर सीधे निगरानी कर सकते हैं.

दोहराए phasic तंत्रिका के 5 हर्ट्ज उत्तेजना बड़े EPSPs कि कई मिनट के बाद बहुत उदास हो जाते हैं को जन्म देता है है. अवसाद के इस प्रकार सन्धिपाद phasic neuromuscular जंक्शनों (एटवुड और कूपर, 1996) में आम है. phasic टर्मिनलों के साथ – साथ टॉनिक टर्मिनलों के उपस्थिति के एक आकलन करने के लिए किया जाए या नहीं postsynaptic लक्ष्य बहुत phasic मोटर न्यूरॉन के अवसाद के दौरान और बाद में संशोधित किया गया है की अनुमति देता है. (देसाई – शाह एट अल, 2008; देसाई शाह और कूपर, 2009) इसके अलावा, कम उत्पादन टर्मिनलों तंत्र है कि synaptic सुविधा आबाद की जांच के लिए एक अच्छी तैयारी प्रदान करते हैं

उच्च उत्पादन टर्मिनलों एक खेल का मैदान उपलब्ध कराने के synaptic अवसाद और वसूली की प्रक्रिया की दर में मॉडुलन जांच. पहुँच और व्यवहार्य तैयारी synaptic अवसाद के पीछे तंत्र का गूढ़ रहस्य में मदद करनी चाहिए. इस क्रेफ़िश पैर extensor तैयारी में, serotonin के exogenous आवेदन synaptic अवसाद और संभवतः synaptic पुटिका पूल की लामबंदी की जांच आगे बढ़ाने के एक साधन की वसूली की जांच के लिए एक और उपकरण है. यह तैयारी कई प्रयोगात्मक लाभ प्रदान करता है, के बाद से व्यक्तिगत मांसपेशी फाइबर दोनों phasic और टॉनिक मोटर न्यूरॉन्स द्वारा innervated हैं.

चूंकि serotonin के vesicles कि पैदा की उत्तेजना के साथ जारी कर रहे हैं की संख्या बढ़ जाती है, और क्योंकि यह अवसाद के दौरान वसूली को बढ़ावा देता है, यह स्पष्ट है कि वहाँ serotonin के वर्तमान के साथ संलयन की संभावना बढ़ाने के लिए पुटिका पूल के कुछ मॉडुलन है (जॉनस्टोन एट अल, 2008 , Logsdon एट अल, 2006, एट अल स्पार्क्स, 2004).. मॉडल है कि कम आवृत्ति उत्तेजना, के रूप में एक उदास राज्य का विरोध किया है, के दौरान पुटिका पूल के presynaptic तंत्रिका टर्मिनल के भीतर गतिशीलता को समझाना होगा भी विभिन्न प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है कि इस तैयारी के साथ संभव हो रहे हैं के बीच विचार किया जाना चाहिए.

यह अन्य प्रणालियों में उल्लेख किया गया है कि पुटिका पूल के बारे में 30% एक तेजी से रिसाइकिलिंग आए, जबकि एक पारंपरिक धीमी रीसाइक्लिंग पथ के माध्यम से पुनर्नवीनीकरण vesicles के बाकी endoplasmic जालिका (Harata एट अल, 2001 के माध्यम से जाओ,. Tsien एट अल. ,) 2001. इस तरह की दोहरी पथ भी इस प्रणाली में मौजूद हो सकता है. यदि एटीपी presynaptic टर्मिनल के उदास राज्य में कमी है, तो डॉकिंग और undocking के लिए होते हैं करने में सक्षम नहीं हो सकता है, इस प्रकार, बहुत अधिक उतार vesicles synaptic सतह पर रहेगा. के बाद से अधिक vesicles तेजी जारी कर रहे हैं जब टर्मिनल 5 हिंदुस्तान टाइम्स को उजागर कर रहे हैं, यह संभव है कि और अधिक आसानी से Releasable पूल (RRV) के भीतर निहित हैं. हालांकि, उदास राज्य में, कम एटीपी के साथ, डॉकिंग और undocking 5 हिंदुस्तान टाइम्स, जो फिर से synaptic सतह पर उतार vesicles के पत्ते की उपस्थिति में भी अवरुद्ध हो सकता है. चूंकि प्रारंभिक आंकड़ों से पता चलता है कि अधिक vesicles समय पर लंबे समय तक 5 हिंदुस्तान टाइम्स जोखिम और उत्तेजना, तेज और धीमी गति से रीसाइक्लिंग रास्तों से पुटिका पूल का वितरण फिर से जारी करने के लिए सक्षम vesicles (जॉनस्टोन एट अल से विषम हो सकता है के साथ जारी कर रहे हैं. , 2008, समीक्षाएँ – देसाई – शाह एट अल, 2008 देख, देसाई शाह और कूपर, 2009)

Postsynaptic धाराओं और मोटर तंत्रिका टर्मिनल के परिभाषित क्षेत्रों से एकल क्वांटा के उपायों का केन्द्र macropatch रिकॉर्डिंग की तकनीक के साथ एक सवाल पूछने के लिए निर्धारित कर सकते हैं कि क्या synaptic अवसाद कम vesicles जारी किया जा रहा का एक परिणाम के रूप में या क्योंकि समारोह के परिवर्तन होने वाली है postsynaptic रिसेप्टर्स की. यह दिखाया गया है कि vesicles अधिक इस तैयारी के phasic NMJ में एक समान कैल्शियम जोखिम के लिए संलयन प्रति संवेदनशील हैं (मिलर एट अल 2005), जो उच्च के लिए की संभावना खातों phasic (टर्मिनलों Msghina एट अल के quantal सामग्री का मतलब है. , 1998, 1999). इसके अलावा, कैल्शियम बंधनकारी प्रोटीन frequenin में मतभेद (Jeromin एट अल., 1999) और ultrastructure (राजा एट अल, 1996) अंतर synaptic प्रभावकारिता (कूपर के लिए योगदानएट अल 2003.).

(; कूपर एट अल, 2003. Bradacs एट अल, 1997) कुछ पूर्व अध्ययन extensor मांसपेशी फाइबर की मांसपेशी phenotype का पता लगाया है. मिश्रित फाइबर प्रकार क्रेफ़िश में विशुद्ध रूप से टॉनिक और phasic फाइबर प्रकार के लिए मांसपेशियों के भेदभाव के विनियमन तुलना पैर extensor innervated है कि dully के लिए की तरह, मांसपेशियों phenotype अभिव्यक्ति और विनियमन (LaFramboise एट अल, 2000 के लिए सुराग प्रदान कर सकता है; Sohn एट अल, 2000, Griffis एट अल, 2001;. Mykles एट अल, 2002)..

कई मौलिक सवालों तंत्रिका जीव विज्ञान में संबोधित किया रहते हैं, और इस तैयारी उनमें से कुछ से निपटने में सहायता कर सकते हैं. आज क्षेत्र में ब्याज के कुछ विषय है कि पैर extensor के साथ संपर्क किया जा सकता शामिल हैं: 1) सेलुलर तंत्र है कि उच्च आउटपुट टर्मिनल के भीतर synaptic अवसाद आबाद (सीए 2 की कमी के कारण अवसाद है का निर्धारण + प्रविष्टि, एक सक्षम की कमी आसानी से Releasable पुटिका (RRV) पूल, और / या बदल postsynaptic ग्रहणशीलता?) 2) 5-HT यंत्रवत भूमिका निर्धारण जब synaptic अवसाद के शामिल करने के लिए एक तेजी से वसूली, और 3 को बढ़ावा देने के बाद लागू) निर्धारण क्या quantal के आकार धाराओं कि उत्तेजक phasic टर्मिनलों से उत्पन्न अवसाद की प्रेरण synaptic अवसाद के पूर्व और बाद synaptic उपकरणों का पता के दौरान बदल रहे हैं.

यह NMJ चल रहे अनुसंधान और भविष्य जांचकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि यह हमें सक्षम बनाता है के लिए प्रासंगिक जानकारी है कि synaptic प्रदर्शन के अधीनस्थ तंत्र के रूप में विज्ञप्ति जारी की साइटों पर सीधे मापा पते प्राप्त है. इस क्षेत्र में वर्तमान अनुसंधान 5-HT और पुटिका पूल के गतिशीलता द्वारा synaptic अवसाद के मॉडुलन के बारे में जानकारी प्रदान कर रहा है. इस तरह के सभी तंत्रिका प्रणाली के लिए प्रासंगिक synaptic प्रसारण के मौलिक मूल बातें से संबंधित विषयों.

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

हम संपादकीय सहायता के लिए श्री क्रेग डी. Slaven (अंग्रेजी, केंटकी के विश्वविद्यालय विभाग) धन्यवाद. केंटकी के विश्वविद्यालय, जीव विज्ञान विभाग, कला और विज्ञान के स्नातक अध्ययन और कॉलेज के कार्यालय द्वारा समर्थित है.

Materials

  1. Crayfish (Procambarus clarkii). Atchafalaya Biological Supply Co., Raceland, LA., USA.
  2. Standard crayfish saline:
    • Modified from Van Harreveld’s solution (1936). (in mM) 205 NaCl; 5.3 KCl; 13.5 CaCl22H2O; 2.45 MgCl26H2O; 5 HEPES and adjusted to pH 7.4
  3. Dissection tools: Fine #5 tweezers, fine scissors, knife blade holder, #26002-20 insect pins (all obtained from Fine Science Tools (USA), Inc., 373-G Vintage Park Drive, Foster City, CA 94404-1139)
  4. Sylgard coated dissection dish, a recording dish either constructed with suction electrode or use a suction electrode and anther manipulator to hold a suction electrode.
  5. Dissecting microscope with zoom function for intracellular recordings. For focal recording on visualized terminals a compound microscope with upright objectives (4 x and 20X) is used. One needs a Hg light source.
  6. Standard intracellular amplifier and A/D board for on line recording to a computer. Electrical signals are recorded on line to a PowerLab/4s interface (ADInstruments, Australia). We use standard software from ADInstruments named Chart or Scope.
  7. Chemicals:
    • We use a vital fluorescent dye, 4 [4 (diethylamino) styryl] N methylpyridinium iodide (4 Di 2 Asp; Molecular Probes, Eugene, OR), to visualize the varicosities (Marigassi et al., 1987; Cooper et al., 1995a). All saline chemicals were obtained from Sigma chemical company (St. Louis, MO).
  8. For intracellular recordings we use glass capillary tubing (catalogue # 30-31-0 from FHC, Brunswick, ME, 04011, USA) and for focal macropatch electrodes we use Kimax-51, Kimble Products Art. No. 34502, ID 0.8-1.1mm, length 100mm. The intracellular electrode should have a resistance of 20 to 30 mOhm. The macropatch electrode is constructed by breaking off the tip of the glass after a fine tip was made from an electrode puller. The broken off tip needs to be a clean perpendicular break about 20μM in diameter. The tip is then heat polished to about 10μM inner diameter. The shaft of the electrode is then run over a heating element to cause it to bend about 45 degrees with a gradual bend. This produces a flat or perpendicular electrode lumen over the nerve terminal as the angle with the micro-manipulator will produce about another 45 degrees to the preparation.
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Riferimenti

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Wu, W. H., Cooper, R. L. Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle. J. Vis. Exp. (45), e2319, doi:10.3791/2319 (2010).
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