小龙虾腿伸肌高和低输出NMJs生理录音

1）导言运动神经元沟通的一个统称作为一种神经肌肉接头（NMJ）突触的肌纤维。 NMJs可以很容易被访问，在大多数的小龙虾肌肉的准备。许多小龙虾NMJs证明非扣球兴奋性突触后电位（EPSP）的突触后树突内产生的哺乳动物的中枢神经系统或阈下的反应，在脊椎动物NMJs中指出的分级电信号（Wiersma范Harreveld，1938年，卡茨Kuffler，1946年） 。小龙虾NMJs可以作为基本突触模型的突触传递和突触分化成提供一般的见解。 一般来说，运动单位，规范动物行为的各个方面，通过突触的沟通NMJs和肌肉的属性类型。自首次观察到的螃蟹和小龙虾接近肌肉（卢卡斯，1907年，1917年）的“快速”和“慢”的肌肉收缩，类似的肌肉收缩分化已在其他小龙虾的肌肉类型，如腹部屈肌（肯尼迪和武田，1965a ，b）和肢体伸展（范Harreveld Wiersma，1936年）。 “快”收缩启动快速反应。例如，小龙虾尾翻转是一个快速的行为。 “慢”的收缩，保持动作缓慢，并帮助保持姿势（Bradacs等，1997） 。已广泛用于通讯以“快”和“慢”的肌肉收缩，“阶段性/高输出”和“补药/低产出”来形容运动神经元。在速度和肌肉收缩的时间不同的是在与突触前，在突触的结构和突触强度的差异（王等，1996 ）的一部分。肌原纤维蛋白异构体的表达是收缩的差异也很重要，但像腿伸肌，在一个特定的纤维是由两种类型的运动神经元支配的筹备工作，重点是对突触的终端差异，因为终端的份额相同的靶细胞（Mykles等，2002） 。早先的研究中研究的腿伸了两个兴奋的运动轴突和描述的阶段性和补品的表型 （Bradacs等， 1997）。在这份报告中，我们将演示如何进行清扫和取得的录音，以便其他人可以进一步探讨这些神经末梢的突触分化的属性。 观看与透射电子显微镜，各种系列的小龙虾腿伸肌肉的补品和阶段性终端获得的部分透露，补虚终端包含更多的定价比阶段性终端水泡;线粒体中较为多见，在进补的神经元，并阶段性终端的突触更复杂的比那些低产出突触，因为它们包含多个活动区，具有不同间距“（Miller等，2002年，斯通等，2008; King等，1996;。Bradacs等，1997 ）。低输出进补终端也阶段性终端（Cooper 等人 ，2003年）相比，更容易加强与突触传递神经调节血清素（5 -羟色胺） 。 事实上，补品和阶段性NMJ相同的肌纤维上，可以更容易地评估对一个给定的肌纤维突触前的差异，肌肉疲劳，抑郁症的突触和突触的串扰问题。各种问题仍有待解决，如是否有在突触后受体的密度和谷氨酸受体亚型在突触后进补和阶段性的终端目标的差异，在此准备，但一个更好地了解这些在解剖和生理的根本区别两个电机的单位，将有助于建立更深厚的知识基础。希望是突触准备在此学到的基本原则将适用于其他各项准备工作突触，并会加强在这个小龙虾的突触模型的未来调查。 2）方法所有的实验都进行中型龙虾（ 克氏螯虾 ）的第一或第二的步行腿。动物被单独安置在与oxygenized水的塑料容器。动物房温度范围在13 ° C – 16 ° C。动物们喂干鱼食和每周一次的基础上改变了水。 图1：一个小龙虾步行腿和6个远段的原理图。 在小龙虾腿走路的远端方面在解剖学上分为6段（图1）。位于小腿伸meropodite，将被隔离的神经束，接近meropodite ischiopodite联合。补药或阶段性的轴突可以Ë选择性地刺激需要后，他们所承受的生理目的。 Cooper和Cooper（2009）描述的初始剥离的一些方面，包括揭露meropodite地区内的揭幕战中运动神经元励磁的方法，但他们的描述不提供保护免受损害伸肌所需的照料，因为它是没有需要解决的开门红肌肉准备。为了保护伸，第一或第二的步行腿的小龙虾从，测量体长6-10厘米（阿查法拉亚生物供应公司，Raceland，LA），通过诱导动物肢体有力捏automize远端ischiopodite段骨折平面。腿放在夹层板与侧（外侧）面对观众。腿转身，直到观众可以肯定外（外侧）朝上夹层板，通常与拱形侧（图2）。配售一块纸巾的腿，使得更容易打开的准备，而这些削减。 图2：侧方的meropodite，通常是拱形侧，是夹层板朝上.. 用手术刀刀片断路器和持有人，一个锋利的刀片是用来蚀刻的角质层，直到刚刚切割meropodite段在图3所示的模式通过。护理是采取不削减太远meropodite carpopodite联合远端背侧腹侧切开。 图3：行作为建议图案蚀刻角质层窗口meropodite段。 放置在盐水的准备工作。解剖盘应该有一个底部Sylgard（道康宁）涂层（厚1cm）。Sylgard是用于使昆虫引脚可分为卡仍然持有的准备。在这一点上，脚被卡在中间的carpopodite部分，并在背方面ischiopodite段（图4）。解剖的准备沐浴在标准的小龙虾生理盐水，范Harreveld的解决方案（1936年），这是205氯化钠修改; 5.3KCl; 13.5 氯化钙2 · 2H 2 O; 2.45 氯化镁2 · 6H 2 O 5 HEPES和调整，以pH值7.4（毫米）。 图4：削减窗口meropodite段升空。注意解剖引脚的位置。 在远端地区的角质层轻轻地抬起和肌纤维被切断从角质层，对基地的腿招。角质层可以升空。 在meropodite carpopodite联合apodeme（肌腱）被切断。一针放在屈肌腱的内表面切（图5）。这是削减用镊子退出解除在尾方向（图6），暴露的主要腿部神经和伸肌和屈肌肌腱，然后捏。 图5：屈肌apodeme取代用大头针屈突出。 图6：屈肌apodeme被切断，小心拆除，以免损坏主要小腿神经。 主要的腿神经被切断meropodite carpopodite联合，并仔细地拉了过来伸肌回。内侧肌肉的表面是在本研究中使用。从主小腿神经伸肌的神经分离，可以提高轻轻拉动的主要腿部神经的远侧断端一侧的准备。剥离时伸肌主要小腿神经轴突的小树枝可能需要削减。这些都是从抑制运动神经元伸肌分支。较大的分支从附近的meropodite近端的小腿神经丛是利益的小神经束。 图7：主要的腿神经被切断，近端方向拉。 可以看出，这种神经束与亚甲基蓝染色（图8）或4 – DI – 2 – ASP荧光染色（图9）。 图8：伸肌与亚甲蓝染色。注意轴突的分支和两个随时可见的神经轴突内。红色箭头丹麦的神经轨道。 图9：4 – DI – 2 – ASP的运动神经染色轴突。进补轴突是由于线粒体含量增加更明亮可见。 图10A：4 – DI – 2 – ASP的染色的阶段性和补品神经元的个人终端。请注意进补终端和薄性质的阶段性终端膨体。 图10B构造说 图10C -阶段性指出 3）生理资料要观察的补药或阶段性的神经元的兴奋性突触后电位（EPSPS），孤立的轴突在神经束之一是刺激吸草刺激电极连接（图11），而在肌肉细胞内的潜力监测（斯通等 ，2008）。在70 Hz的刺激，以促进为低输出NMJs促进救灾，适用于补虚轴突或单脉冲（1赫兹）是适用于阶段性的轴突，以获得高输出大EPSPS NMJs如图所示在图12。 EPSPS都记录到计算机通过PowerLab/4s接口。 图11：刺激电极放置在一个单一的神经束内的轴突。注意绿线概述2主轴突。 图12：补药或阶段性的神经元细胞内的录音获得的突触后电位（EPSPS ）。 在促进突触和突触抑郁性质的调查，可以接触各种实验范式与低，产量高NMJs。便利的低输出NMJs取决于频率，为约20刺激（图13）20，40和60赫兹脉冲所示。 图13：在响应了三种不同的频率20，40和60赫兹在正常的小龙虾生理盐水刺激脉冲的培养EPSPS。 突触抑郁率的刺激频率也与高输出NMJs。图14显示了连续5赫兹的刺激郁闷NMJ超过30分钟。随着刺激频率较高，准备将抑制更为迅速（Bradacs 等 ，1997年）。 图14：EPSP的幅度在5 Hz的刺激诱 ​​发抑郁症的阶段性反应。 4）量子反应一个开门红肌肉小龙虾（Cooper和Cooper，2009）中描述的类似的程序是用于在此准备。直接通过识别区域的神经末梢量子EPSPS记录放在宏观补丁记录电极对突触膨体流明，具有重要的染料4 -二- 2 – ASP（5微米，5分钟的治疗 ，Cooper等可视化，1995; Magrassi 等 ，1987）。可以记录沿神经末梢自发以及诱发量子反应。诱发和自发突触电位记录与宏观补丁电极（Dudel，1981;武伊托维奇等 ，1991;。Mallart，1993年）。 Kimax玻璃（外径：1.5毫米），被拉到和火抛光生产内径从10到20微米（图15）的补丁提示。 图15：宏观补丁的记录电极流明.. 电极内腔充满了沐浴液。该放大器是上述细胞内的录音中使用的相同。通过测试电流脉冲通过电极，电极和密封性能，可确定。在我们的实验中，密封电阻范围从0.3至1.0毫欧和电极电阻从0.5至1.0毫欧不等。密封电阻可以监视整个录音。 量子事件的直接计数可能与低刺激的频率。量子事件对于每个诱发反应，可以很容易地确定为低输出端子（FigurE 16）。这些直接计数，可以帮助估计平均量子含量（德尔卡斯蒂略卡茨，1954年，Cooper 等人，1995年） 。由于诱发的高输出NMJs产生多量子诱发事件，平均振幅或地区的挠度，平均峰值振幅或面积自燃事件，可用于近似的平均量子含量 （Cooper等人。 1995年）。 图16焦距的痕迹，记录从一个阶段性和一剂强心剂NMJ 。 图17