Le registrazioni fisiologiche NMJs uscita alta e bassa del muscolo estensore gamberi Leg

1) Introduzione Motoneuroni comunicare con una fibra muscolare a livello delle sinapsi, che sono indicate collettivamente come una giunzione neuromuscolare (MNJ). NMJs si può accedere facilmente a preparazioni più gamberi muscolare. Molti dei NMJs gamberi dimostrare le potenzialità eccitatori non spiking postsinaptici (EPSP) simile ai segnali elettrici generati classificato in dendriti postsinaptici nel sistema nervoso centrale dei mammiferi o risposte sottosoglia osservato nella NMJs vertebrati (Wiersma & Van Harreveld, 1938; Kuffler & Katz, 1946) . Il NMJs gambero può servire come modello fondamentale sinaptica di fornire uno sguardo generale in trasmissione sinaptica e la differenziazione sinaptica. In generale, unità motorie regolano gli aspetti del comportamento animale tramite il tipo di comunicazione sinaptica a NMJs e le proprietà dei muscoli. Dal momento che la prima osservazione di "fast" e "lento" contrazioni muscolari in granchi e gamberi di fiume più vicino muscolare (Lucas, 1907, 1917), simile differenziazione muscolare contrattile è stato descritto in altri tipi muscolare gamberi come flessori addominale (Kennedy & Takeda, 1965a , b) ed estensori degli arti (Van Harreveld & Wiersma, 1936). "Fast" contrazioni avviare risposte rapide. Per esempio, il flip coda gambero è un comportamento veloce. "Slow" contrazioni mantenere movimenti lenti e contribuire a mantenere una postura (Bradacs et al., 1997). Corrispondente a "fast" e "lento" contrazioni muscolari ", fasica / ad alto rendimento" e "output tonico / basso" sono ampiamente utilizzati per descrivere i motoneuroni. La differenza di velocità e tempi di contrazione muscolare è in parte riconducibile a differenze nella struttura presinaptica sinaptica e la forza sinaptica (King et al., 1996). Isoforma proteica miofibrillare espressione è importante anche per le differenze contrattile, ma in preparazioni come quello del muscolo estensore della gamba, in cui è innervato una fibra data da entrambi i tipi di neuroni motori, l'attenzione è sulle differenze dei terminali sinaptici, dal momento che i terminali parti la cella di destinazione stesso (Mykles et al., 2002). Un precedente studio ha esaminato i due assoni motori eccitatori del estensori gamba e descritti i fenotipi fasica e tonica (Bradacs et al., 1997). In questo rapporto, si dimostra come eseguire la dissezione e di ottenere le registrazioni in modo che altri possano investigare le proprietà della differenziazione sinaptici di queste terminazioni nervose. Visto con microscopia elettronica a trasmissione, diverse serie di sezioni ottenute dalla tonica e terminali fasica sul muscolo estensore della gamba gamberi rivelato che i terminali tonico contengono più vescicole RRP di terminali fasica, i mitocondri sono più frequenti nei neuroni tonico, e le sinapsi sui terminali sono fasica più complessi di quelli sulle sinapsi a bassa potenza, in quanto contengono più zone attive con spaziatura varia (Miller et al, 2002; Johnstone et al, 2008;. King et al, 1996;.. Bradacs et al, 1997). La bassa resa terminali tonico sono anche più sensibili a rafforzare la trasmissione sinaptica con il neuromediatore serotonina (5-HT) che sono i terminali fasica (Cooper et al., 2003). Il fatto che la tonica e fasica NMJ sono presenti sulla stessa fibra muscolare rende più facile valutare le differenze presinaptico su una fibra muscolare dato e di affrontare questioni di affaticamento muscolare, depressione sinaptica e cross talk sinaptica. Diverse questioni rimangono da affrontare in questa preparazione, ad esempio se ci sono differenze nella densità dei recettori post-sinaptici e sottotipi di recettori del glutammato nel obiettivi postsinaptica per il tonico e terminali fasica, ma una migliore comprensione delle differenze fondamentali nella anatomia e la fisiologia di questi due unità motore sarà di aiuto nella costruzione di una base di conoscenza più profonda. La speranza è che i principi fondamentali imparato in questa preparazione sinaptica saranno applicabili a sinapsi altre preparazioni diverse e migliorerà future indagini in questo modello sinaptica del gambero. 2) Metodi Tutti gli esperimenti sono condotti sulle gambe prima o la seconda a piedi di gamberi di medie dimensioni (Procambarus clarkii). Gli animali sono alloggiati individualmente in contenitori di plastica con acqua ossigenato. La temperatura della stanza animale è nel range di 13 ° C-16 ° C. Gli animali vengono nutriti con cibo secco i pesci e l'acqua cambiata su base settimanale. Figura 1: Schema di una gamba gamberi a piedi e sei segmenti distali. La porzione distale della gamba camminando in un gambero è anatomicamente diviso in sei segmenti (Figura 1). L'estensore della gamba si trova nel meropodite, e il fascio nervoso che sarà isolata è vicino al ischiopodite meropodite comune. L'assone toniche o fasiche possono be selettivamente stimolati richiesto dagli scopi fisiologici dopo che sono stati esposti. Cooper e Cooper (2009) descritto alcuni aspetti della dissezione iniziale, compresi i metodi per smascherare il excitor del motore opener neurone all'interno della regione meropodite, ma la loro descrizione non fornisce la necessaria cura per la protezione del muscolo estensore dai danni, come è stato non è necessario per affrontare la preparazione muscolare opener. Al fine di proteggere l'estensore, la gamba a piedi prima o la seconda viene rimosso dal gambero di fiume, che misura 6-10 cm di lunghezza del corpo (Atchafalaya biologica Supply Co., Raceland, LA), inducendo l'animale per automatizzare l'arto con pizzicare forte distale al piano di frattura nel segmento ischiopodite. La gamba è posto sul piatto con la dissezione laterale (lato esterno) rivolto verso lo spettatore. La gamba è girato fino a quando lo spettatore può essere certo l'esterno (laterale) è rivolto verso l'alto sulla piastra di dissezione, di solito con il lato ad arco verso l'alto (Figura 2). Ponendo la gamba su un pezzo di carta velina è più facile girare la preparazione rendendo questi tagli. Figura 2: La parte laterale del meropodite, di solito il lato che è ad arco, è rivolto verso l'alto sul piatto dissezione .. Con un interruttore di lama di bisturi e titolare, una lama di rasoio affilato è usato per incidere il cuticola fino a poco attraverso il taglio nel modello mostrato in Figura 3 per il segmento meropodite. Si fa attenzione a non tagliare troppo distale sulla dorsale di tagliare ventrale dal meropodite-carpopodite comune. Figura 3: Il segmento meropodite con linee come modello suggerito per l'incisione fuori dalla finestra della cuticola. Il preparato va messo in soluzione salina. Il piatto dissezione dovrebbe avere un (Dow Corning) Sylgard rivestimento sulla parte inferiore (1 cm di spessore). Il Sylgard è usato in modo che i pin di insetti possono essere bloccati dentro per tenere la preparazione ancora. A questo punto, un pin è bloccato nel bel mezzo del segmento carpopodite e nella parte dorsale del segmento ischiopodite (Figura 4). Preparati sezionato sono immersi in soluzione salina gamberi standard, modificato dalla soluzione Van Harreveld s (1936), che è fatto con 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2; 2H 2 O; 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES e regolato pH 7.4 (in mm). Figura 4: Il segmento meropodite con finestra taglio viene sollevato. Notare la posizione dei perni dissezione. La cuticola è leggermente sollevato nella regione distale e le fibre muscolari sono tagliati fuori dalla cuticola rendendo colpi verso la base della gamba. La cuticola può essere sollevato. Il apodeme (tendine) viene tagliata a meropodite-carpopodite comune. Un perno è posto sulla superficie interna del tendine flessore per mostrare dove il taglio deve essere effettuato (Figura 5). Il tendine viene poi schiacciato dove è stato tagliato con le pinzette e il muscolo flessore tirato fuori sollevandola in direzione caudale (Figura 6), esponendo il nervo principale gamba e il muscolo estensore. Figura 5: Il apodeme del muscolo flessore è evidenziato spostando dal flessore con uno spillo. Figura 6: Il apodeme del muscolo flessore è tagliato e rimosso con cura per non danneggiare il nervo principale gamba. Il nervo della gamba principale è tagliato alla meropodite-carpopodite comune e con attenzione tirato indietro al muscolo estensore. La superficie mediale del muscolo è usato in tutto questo studio. La separazione del nervo al muscolo estensore del nervo della gamba principale può essere migliorata tirando delicatamente il moncone distale del nervo della gamba principale al fianco della preparazione. Quando il nervo principale peeling gamba posteriore sopra il muscolo estensore, piccoli rami di assone può essere necessario tagliare. Questi sono i rami dal motoneurone inibitorio al muscolo estensore. Il bundle più grandi che si diramano dal nervo della gamba principale verso la fine prossimale del meropodite è il fascio nervo piccolo di interesse. Figura 7: Il nervo della gamba principale è tagliato e tirato indietro in direzione prossimale. Questo bundle nervo può essere visto con colorazione blu di metilene (Figura 8) o con 4-Di-2-ASP macchia fluorescente (Figura 9). Figura 8: Il muscolo estensore macchiato con blu di metilene. Si noti la ramificazione degli assoni e ladue assoni facilmente visibile all'interno del nervo. Frecce rosse delimitano la pista del nervo. Figura 9: Gli assoni del nervo motore macchiato con 4-Di-2-ASP. L'assone tonica è più luminosa visibile a causa del maggiore contenuto mitocondriale. Figura 10A: singoli terminali dei neuroni fasica e tonica colorati con 4-Di-2-ASP. Si noti la varicosità sui terminali tonica e la natura sottile dei terminali fasica. Figura 10B-Tonic notato Figura 10C-fasica notato 3) profili fisiologici Per osservare il potenziale eccitatorio postsinaptico (EPSPS) dei neuroni tonica o fasica, uno degli assoni isolate nel bundle nervo è stimolato da un elettrodo di aspirazione (Figura 11) collegato a uno stimolatore Grass mentre potenziale intracellulare nel muscolo vengono monitorati (Johnstone et al., 2008). Stimolazione a 70 Hz viene applicato l'assone tonico al fine di promuovere una risposta agevolata per i NMJs bassa uscita, o un singolo impulso (1 Hz) viene applicato l'assone fasica al fine di ottenere epsps grande del NMJs alto rendimento, come indicato nella figura 12. Il EPSPS sono registrati ad un computer tramite un'interfaccia PowerLab/4s. Figura 11: Stimolare l'elettrodo posto nel corso di un singolo assone all'interno del fascio nervoso. Si noti la linea verde che delinea i 2 assoni principale. Figura 12: i potenziali postsinaptici (EPSPS) dei neuroni tonica o fasica come ottenute da registrazioni intracellulari. Indagine nella natura della facilitazione sinaptica e la depressione sinaptica può essere avvicinato da diversi paradigmi sperimentali con il NMJs uscita bassa e alta. Facilitazione del NMJs uscita bassa dipende dalla frequenza, come indicato per gli impulsi di 20 Hz, 40 e 60 di circa 20 stimoli (Figura 13). Figura 13: EPSPS in risposta ad un treno di impulsi di stimolazione dato a tre differenti frequenze 20, 40 e 60 Hz in soluzione salina normale gamberi. Il tasso di depressione sinaptica alla frequenza di stimolazione è anche legato alla NMJs alto rendimento. La figura 14 mostra una continua stimolazione dei 5 Hz premendo il NMJ oltre 30 min. Con la frequenza di stimolazione più alta, la preparazione si deprimono più rapidamente (Bradacs et al., 1997). Figura 14: EPSP ampiezza della risposta fasica durante 5 Hz stimolazione per indurre depressione. 4) Le risposte quantico Una procedura simile a quella descritta per il muscolo opener del gambero (Cooper e Cooper, 2009) è usato in questa preparazione. Il EPSPS quantali direttamente sopra le regioni identificabili del terminale nervoso sono registrati ponendo il lume di una macro-patch elettrodo registrazione su varicosità sinaptiche visualizzati con il colorante vitale 4-Di-2-Asp (5 mM, a 5 minuti di trattamento, Cooper et al, 1995;. Magrassi et al, 1987).. Il spontaneo così come evocato risposte quantali possono essere registrate lungo le terminazioni nervose. I potenziali evocati e spontanea sinaptica sono registrati con la macro-patch elettrodo (Dudel, 1981; Wojtowicz et al, 1991;. Mallart, 1993). Kimax vetro (diametro esterno: 1,5 mm) è stato tirato e il fuoco-lucido per la produzione di punte di patch con diametro interno da 10 a 20 micron (Figura 15). Figura 15: Il lume di una macro-patch elettrodo di registrazione .. Il lume del l'elettrodo viene riempito con il mezzo bagno. L'amplificatore è la stessa di quella utilizzata per le registrazioni intracellulari di cui sopra. Elettrodi e la resistenza di tenuta può essere determinato facendo passare impulsi di corrente di prova attraverso l'elettrodo. Nei nostri esperimenti, resistenze sigillo variava dal 0,3-1,0 MOhm e la resistenza elettrodo variava dal 0,5-1,0 MOhm. Resistenza sigillo può essere monitorato per tutta la registrazione. Conteggio diretto degli eventi quantali è possibile con basse frequenze di stimolazione. Per ogni risposta evocata, il numero di eventi quantali può essere facilmente determinato per i morsetti di uscita bassa (Figure 16). Questi conteggi diretto può aiutare a stimare il contenuto medio quantal (Del Castillo e Katz, 1954;. Cooper et al, 1995). Poiché il NMJs evocato ad alto rendimento produrre eventi evocati multi-quantica, l'ampiezza media o area del deviazioni, insieme con l'ampiezza di picco media o l'area degli eventi spontanei, può essere utilizzato per stimare il contenuto medio quantal (Cooper et al. 1995). Figura 16 tracce registrate da una focale fasica e NMJ tonico. Figura 17