Физиологические Записи высокого и низкого NMJs Выход на Экстензорных мышцы ног раков

1) Введение Моторных нейронов общаться с мышечных волокон в синапсах, которые совместно именуемые нервно-мышечном соединении (NMJ). NMJs может быть легко доступен в большинстве подготовки раков мышцы. Многие из раков NMJs продемонстрировать не-пики возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП), аналогичные градуированных электрических сигналов, генерируемых в постсинаптических дендритов в ЦНС млекопитающих или подпороговых ответов отмечено в NMJs позвоночных (Вирсма и Ван Harreveld, 1938; Кац и Kuffler, 1946) . Раков NMJs может служить фундаментальным синаптических модели обеспечения общей взглянуть на синаптическую передачу и синаптической дифференцировки. Как правило, моторных единиц регулируют аспекты поведения животных с помощью типа синаптической связи на NMJs и свойства мышц. Так как первое наблюдение "быстрых" и "медленные" мышечные сокращения в крабов и раков ближе мышц (Lucas, 1907, 1917), подобно мышечной сократительной дифференциация была описана в других раков мышц типов, таких как брюшной сгибатели (Kennedy & Такеда, 1965 , б) и разгибателей конечностей (Van Harreveld и Вирсма, 1936). "Быстрые" сокращения инициировать быстрые ответы. Например, флип раков хвост быстро поведения. "Медленный" сокращений поддерживать медленные движения и помогают поддерживать позу (Bradacs и соавт., 1997). В соответствии с "быстрыми" и "медленные" мышечные сокращения, "фазовый / высокая производительность» и «тоник / низкий выход" широко используется для описания моторных нейронов. Разница в скорости и времени мышечного сокращения в части, связанной с пресинаптической различия в синаптические структуры и синаптической силы (King и соавт., 1996). Миофибриллярных белка изоформы выражение также имеет важное значение в сократительной различия, но в препаратах как и мышцы ног разгибателей, в котором дано волокна иннервируются обоими типами моторных нейронов, акцент делается на синаптическую различий терминалов, так как доля терминалов же клетки-мишени (Mykles и соавт., 2002). В более раннем исследовании рассмотрены два возбуждающих аксонов двигатель ногу разгибателей и описал фазической и тонической фенотипы (Bradacs и соавт., 1997). В этом отчете мы показываем, как выполнить рассечение и получить записи, чтобы другие могли продолжить изучение свойств синаптической дифференциации этих нервных окончаний. Просмотров с просвечивающей электронной микроскопии, различные ряда секций, полученных из тонизирующее и фазовый терминалов на раков мышц разгибателей ног, показало, что тоник терминалы содержат больше RRP пузырьки, чем фазовый терминалов; митохондрий более распространены в тонических нейронов и синапсов на фазовый терминалы более сложные, чем те, на низкой выходной синапсов, так как они содержат множество активных зон с различным интервалом (Миллер и др., 2002; Джонстон и др., 2008;. Король и др., 1996;.. Bradacs и др., 1997). Низким выходным клеммам тоник также более восприимчивы к повышению синаптической передачи с серотонином нейромодулятора (5-HT), чем фазовый терминалов (Cooper и соавт., 2003). Тот факт, что тоника и фазической NMJ присутствуют на тех же мышечных волокон облегчает оценку пресинаптических разногласия по данной мышечных волокон и для решения вопросов мышечной усталости, депрессии и синаптических синаптических говорить крест. Различные вопросы еще предстоит решить в этой подготовке, например, является ли Существуют различия в постсинаптической плотности рецепторов и подтипов глутаматных рецепторов в постсинаптической цели тонизирующее и фазовый терминалов, но лучше понять фундаментальные различия в анатомии и физиологии этих два моторных единиц поможет в создании более глубоких знаний. Надеюсь, что основополагающие принципы узнал в этом синаптические препарат будет применима и к другим синапсов в различных препаратов и увеличит будущие исследования в этой модели синаптической раков. 2) методы Все эксперименты проводятся на первом или втором ходьбе ноги среднего раков (Procambarus clarkii). Животные индивидуально размещаются в пластиковых контейнерах с обогащенную кислородом воду. Температура животных комнате находится в диапазоне от 13 ° C-16 ° C. Животных кормят сухим кормом рыбы и воды изменился на еженедельной основе. Рисунок 1: Схема раков ходьбе ноги и шесть дистальных сегментов. Дистального аспект ходьбе ногу в раков анатомически разделен на шесть сегментов (рис. 1). Разгибателей ног находится в meropodite и нервов пакет, который будет изолирован близка к meropodite ischiopodite сустава. Тоником или фазовый аксонов могут быть выборочно стимулировать как нeeded для физиологических целей после того как они подвергаются. Купер и Купер (2009) описаны некоторые аспекты начальной рассечение, включая методы для раскрытия excitor из нож двигательных нейронов в meropodite регионе, но их описание не дает забота, необходимые для защиты разгибателей мышц от повреждений, как это было не, необходимых для решения подготовке нож мышцы. В целях защиты разгибателей, первый или второй ходьбе нога будет удален из раков, измерения 6-10 см в длине тела (Атчафалайя Биологические питания Ко, Raceland, LA), вызывая животный автоматизировать конечности с силовой щипать дистальнее плоскость перелома в ischiopodite сегменте. Нога находится на вскрытии пластины с боковыми (внешняя сторона), стоящие перед зрителем. Нога повернулась вокруг, пока зритель может быть уверен, снаружи (боковые стороны) вверх на вскрытии пластины, как правило, с арочными стороной вверх (рис. 2). Размещение ногой на папиросную бумагу легче превратить подготовку, делая эти сокращения. Рисунок 2: боковой meropodite, как правило, сторона, которая является изогнутая, вверх на вскрытии пластины. С скальпель выключателя лезвия и держатель, острое лезвие бритвы используют для травления кутикулы пока только прорезая в картине показано на рисунке 3 meropodite сегменте. Уход берется не зайти слишком далеко дистальных на спины к брюху сокращены на meropodite-карпоподит сустава. Рисунок 3: meropodite сегменте с линиями, как предложил шаблон для травления из окна кутикулы. Подготовка находится в физиологическом растворе. Рассечение блюдо должно иметь Sylgard (Dow Corning) покрытие на нижней (1 см толщиной). Sylgard используется так, чтобы насекомое контакты могут застрять в ней на проведение подготовки до сих пор. На данный момент, контактный застрял в середине карпоподит сегменте и в спинной части сегмента ischiopodite (рис. 4). Расчлененный препараты купались в стандартном солевом раков, модифицированный из раствора с Ван Harreveld (1936), который сделан с 205 NaCl; 5.3KCl; 13,5 CaCl 2, 2H 2 O; 2,45 MgCl 2; 6H 2 O, 5 HEPES и доводили до рН 7,4 (в мм). Рисунок 4: meropodite сегменте с вырезом окна быть снят. Обратите внимание на расположение контактов рассечение. Кутикула аккуратно снят в дистальной области и мышечные волокна отрезать от кутикулы, делая ударов к основанию ноги. Кутикула может быть снят. Аподема (сухожилия) режется на meropodite-карпоподит сустава. Контактный помещается на внутренней поверхности сухожилия сгибателей чтобы показать, где сокращение должно быть сделано (рис. 5). Сухожилия то ущипнул, где она была сокращена с пинцетом и сгибателей мышц снял, подняв его в каудальном направлении (рис. 6), подвергая главный нерв ноги и разгибателей мышц. Рисунок 5: аподема мышц сгибателей выделен путем вытеснения его из сгибателя с булавкой. Рисунок 6: аподема мышц сгибателей разрезается и удаляется с осторожностью, чтобы не повредить главный нерв нога. Главный нерв нога режется на meropodite-карпоподит сустава и осторожно вытащил обратно на разгибателей мышц. Медиальной поверхности мышцы, используемые в настоящем исследовании. Разделение нерв разгибателей мышц от главного нерва нога может быть повышена, осторожно потянув дистальной культи главный нерв нога в сторону подготовки. Когда пилинг главный нерв нога назад на разгибателей мышц, мелких ветвей аксона, возможно, придется сократить. Эти ветви от тормозных нейронов двигателя разгибателей мышц. Чем больше пакет отходящие от основной нерв нога у проксимального конца meropodite является небольшой пучок нервов, представляющих интерес. Рисунок 7: главный нерв нога вырезать и убрала в проксимальном направлении. Этот нерв пучок можно увидеть метиленового синего окрашивания (рис. 8) или с 4-Ди-2-ASP флуоресцентные пятна (рис. 9). Рисунок 8: разгибателей мышц окрашенных метиленовым синим. Обратите внимание, аксон ветвление и два хорошо видна аксонов в нерв. Красные стрелки Демарк нерва трек. <br/> Рисунок 9: аксоны окрашенных двигательного нерва с 4-Ди-2-ASP. Тоник аксона ярче видимое в связи с увеличением митохондриальной содержания. Рис 10А: Индивидуальные терминалы фазической и тонические нейроны окрашивали 4-Ди-2-ASP. Обратите внимание, варикоз на тоник терминалов и тонкий характер фазовый терминалов. Рис 10В-Тоник отметил Рис 10C-Фазовые отметил 3) Физиологические профили Для наблюдения возбуждающих постсинаптических потенциалов (ВПСП) из тоником или фазовый нейронов, один из изолированных аксонов в нервных расслоение стимулируется всасывания электрод (рис. 11), подключенных к Трава стимулятор в то время как внутриклеточные потенциалы в мышцах отслеживаются (Джонстон и соавт., 2008). Стимуляция при 70 Гц подается на тоник аксонов в целях содействия способствовало ответ на низкие NMJs выход, или одиночный импульс (1 Гц) применяется к фазовый аксонов, чтобы получить большие ВПСП высокой выходной NMJs как показано на рисунке на рисунке 12. ВПСП записываются на компьютер через интерфейс PowerLab/4s. Рисунок 11: Стимулирование электродом, лежащим в течение одного аксона в нерв расслоения. Обратите внимание на зеленую линию изложением 2 основных аксонов. Рисунок 12: постсинаптических потенциалов (ВПСП) из тоником или фазовый нейроны, полученные от внутриклеточных записей. Исследование в природе синаптических содействия и синаптической депрессии можно подойти различными экспериментальных парадигм с низким и высоким NMJs выход. Содействие низкой NMJs производительность зависит от частоты, как показано на 20, 40 и 60 Гц импульсов около 20 раздражителей (рис. 13). Рисунок 13: ВПСП в ответ на поезде стимуляции импульсами дано на трех разных частотах 20, 40 и 60 Гц в физиологическом растворе раков. Скорость синаптической депрессии к частоте стимуляции также связана с высокой NMJs выход. На рисунке 14 показано непрерывное 5 Гц стимуляции удручает NMJ более 30 мин. При более высоких частот стимуляции, препарат будет подавлять более быстро (Bradacs и соавт., 1997). Рисунок 14: ВПСП амплитудой фазовой ответ в течение 5 Гц стимуляцию, чтобы вызвать депрессию. 4) квантильного Ответы Процедура аналогична описанной для нож мышц раков (Cooper и Cooper, 2009) используется в данном препарате. Квантовой ВПСП прямо над идентифицировать регионы нервного окончания фиксируются путем размещения просвет макро-патч записи электрода на синаптическую варикозов визуализированы с жизненными красителя 4-Ди-2-Asp (5 мкМ, 5-мин лечение, Cooper и др. др., 1995;. Magrassi и др., 1987).. Спонтанное, а также вызвала квантовой ответы могут быть записаны вместе нервных окончаний. Вызывали и спонтанные синаптические потенциалы, записанные с макро-патч электрода (Dudel, 1981; Wojtowicz и др., 1991;. Mallart, 1993). Kimax стекла (наружный диаметр: 1,5 мм) была разобрана и огневой полировкой, чтобы произвести патч советы с внутренним диаметром от 10 до 20 мкм (рис. 15). Рисунок 15: просвет макро-патч записи электрода. Просвет электрод наполнен купания среды. Усилитель же, что и для внутриклеточных записей, упомянутых выше. Электрод и печатью сопротивления может быть определен путем пропускания тест импульсов тока через электрод. В наших экспериментах, печать сопротивления колебались от 0,3 до 1,0 МОм и сопротивления электродов в диапазоне от 0,5 до 1,0 МОм. Печать сопротивление может быть контролируется в течение записи. Прямой подсчет квантовых событий возможно при низких частотах стимуляции. Для каждого вызвала отклик, число квантовых событий могут быть легко определены для низких выходных клемм (рис. 16). Эти прямого счета может помочь оценить среднее содержание квантовой (Del Castillo & Katz, 1954;. Cooper и др., 1995). С вызвала высокий NMJs выход производят несколько квантовых вызвали события, средняя амплитуда или области отклонений, а также средней амплитудой или области спонтанных событий, могут быть использованы для соответствуюximate означает квантовой содержания (Cooper и соавт., 1995). Рисунок 16 Фокусное следы записан с фазической и NMJ тоником. Рисунок 17