Este artigo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica no músculo extensor da perna andando de um lagostim e como os terminais nervosos são visualizados para mostrar as diferenças morfológicas bruta de alta e de baixa produção terminais nervosos.
Nós explicamos em detalhes como expor e realizar gravações eletrofisiológicas de respostas sináptica de alta (fásica) e baixo (tônica) neurônios motores saída inervação do músculo extensor da perna andando de um lagostim. Diferenças distintas estão presentes na fisiologia e morfologia dos terminais nervosos fásicas e tônicas. O axônio tônica contém muitos mais mitocôndrias, permitindo-lhe tirar uma mancha vital mais intensa do que o axônio fásica. Os terminais têm varizes tônica e fásica do terminal é filiforme. Os terminais tônica são baixos em eficácia sináptica, mas mostram dramáticas respostas facilitada. Em contraste, os terminais fásica são ricos em eficácia quântica, mas apresentar depressão sináptica com a estimulação de alta freqüência. A saída quântica é medido com um eletrodo macropatch focal colocados diretamente sobre os terminais nervosos visualizado. Ambos os terminais fásicas e tônicas inervam as fibras musculares mesmo, o que sugere que as diferenças inerentes aos neurônios, em vez de um feedback diferencial retrógrada do músculo, conta para a diferenciação morfológica e fisiológica.
Nós demonstramos neste relatório como dissecar, registrar e quantificar as respostas sinápticas em uma preparação neuromuscular lagostas único em que ambos os terminais de alta e de baixa produção inervam as fibras musculares mesmo. Os preparativos neuromuscular na lagostas oferecem muitas vantagens sobre as junções neuromusculares vertebrados, uma vez que apenas alguns neurônios motores excitatórios são necessários para inervam um músculo, e uma vez que os neurônios são identificáveis, desde a preparação para a preparação (Atwood, 1976). Além disso, o neurotransmissor excitatório é o glutamato, e os potenciais pós-sinápticos excitatórios (EPSP) são classificados, assim, as propriedades biofísicas de eventos classificados são análogas às dendrites dos neurónios no SNC de vertebrados. As correntes quântica, no entanto, podem ser monitoradas diretamente nos locais pós-sinápticos (Cooper et al., 1995).
Estimulação repetitiva 5 Hz do nervo fásica dá origem a EPSPs grandes que se tornam extremamente deprimida depois de vários minutos. Este tipo de depressão é comum em artrópodes fásica neuromuscular junções (Atwood e Cooper, 1996). A presença dos terminais tônica ao lado dos terminais fásica permite avaliar se o alvo pós-sináptica é bastante modificado durante e após a depressão do fásica do neurônio motor. Além disso, os terminais de saída de baixa fornecer uma preparação boa para investigar os mecanismos que estão por trás de facilitação sináptica (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)
Os terminais de saída de alta proporcionar um play ground para investigar a modulação da taxa de depressão sináptica eo processo de recuperação. Preparações acessível e viável deve ajudar a decifrar os mecanismos por trás da depressão sináptica. Nessa preparação extensor lagostas perna, aplicação exógena de serotonina é outra ferramenta para investigar a recuperação da depressão sináptica e, potencialmente, um meio de promover investigação sobre a mobilização de piscinas das vesículas sinápticas. Esta preparação proporciona várias vantagens experimental, já que as fibras musculares individuais são inervadas por neurônios motores tanto fásicas e tônicas.
Como a serotonina aumenta o número de vesículas que são liberados com a estimulação evocada, e uma vez que promove a recuperação durante a depressão, é evidente que há alguma modulação das piscinas vesícula para aumentar a probabilidade de fusão com a presença de serotonina (Johnstone et al., 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modelos que explicam a dinâmica das piscinas vesícula dentro do terminal nervoso pré-sináptico durante a estimulação de baixa freqüência, em oposição a um estado depressivo, também precisam ser considerados entre os diferentes protocolos experimentais que são possíveis com esta preparação.
Tem-se observado em outros sistemas que cerca de 30% do pool vesícula passa por uma reciclagem rápida, enquanto que o resto das vesículas reciclados passar por um caminho tradicional de reciclagem lenta através do retículo endoplasmático (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Tais caminhos dupla também podem estar presentes neste sistema. Se ATP está faltando no estado depressivo do terminal pré-sináptico, em seguida, encaixe e desencaixe pode não ser capaz de ocorrer, assim, muitas vesículas mais descarregados permaneceria na superfície sináptica. Desde vesículas são mais rapidamente liberado quando os terminais estão expostos a 5-HT, é possível que mais estão contidos dentro da piscina prontamente liberável (RRV). No entanto, no estado depressivo, com redução da ATP, a atracação e desatracação podem ser bloqueados, mesmo na presença de 5 HT, que novamente sai vesículas descarregado na superfície sináptica. Desde que os dados preliminares sugerem que as vesículas são liberados ao longo do tempo com a exposição prolongada HT 5 e estimulação, a distribuição da piscina vesícula dos caminhos de reciclagem rápida e lenta pode ser inclinado para ter vesículas competente para re-lançamento (de Johnstone et al. , 2008; ver reviews-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah e Cooper, 2009)
Com as técnicas de gravações macropatch focal das correntes pós-sináptico e medidas de quanta única das regiões definidas do terminal nervoso motor, pode-se fazer perguntas para determinar se a depressão sináptica está ocorrendo como resultado de vesículas menos ser liberado ou por causa de alterações da função de receptores pós-sinápticos. Tem sido demonstrado que as vesículas são mais sensíveis à fusão no MNJ fásica da preparação para uma exposição de cálcio iguais (Miller et al. 2005), o que provavelmente contribui para o maior teor médio de quantal dos terminais fásica (Msghina et al. , 1998, 1999). Além disso, as diferenças no frequenin proteínas, cálcio binding (Jeromin et al., 1999) e ultra-estrutura (King et al., 1996) contribuem para a eficácia diferencial sináptica (Cooperet al., 2003).
Alguns estudos anteriores têm explorado o fenótipo muscular das fibras musculares extensor (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003).. Comparando-se a regulação da diferenciação muscular para tipos de fibras puramente tônica e fásica do crustáceo para tipos de fibras mistas, como para os extensores da perna que é inervada devidamente, pode fornecer pistas para a expressão muscular fenótipo e regulação (LaFramboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..
Muitas questões fundamentais continuam a ser combatidos em neurobiologia, e esta preparação pode ajudar na luta contra alguns deles. A alguns tópicos de interesse no campo, hoje, que pode ser abordada com o extensor da perna incluem: 1) Determinar os mecanismos celulares subjacentes à depressão sináptica dentro alta terminais de saída (Is a depressão devido a uma redução de Ca2 + entrada, falta de uma competente prontamente liberável vesícula piscina (RRV), e / ou pós-sinápticos receptividade alteradas?) 2) Determinar o papel mecanicista da 5-HT, quando aplicado após a indução de depressão sináptica para promover uma recuperação mais rápida, e 3) Determinar se as formas das quantal correntes que surgem a partir da estimulação fásica terminais estão sendo alterados durante a indução de depressão para tratar componentes pré e pós-sináptico de depressão sináptica.
Este MNJ é importante para a investigação em curso e futuros pesquisadores, porque permite-nos obter informação pertinente que aborda os mecanismos de subalterno de desempenho sináptica medida diretamente nos locais de lançamento. A pesquisa atual nesta área é fornecer informações sobre a modulação da depressão sináptica de 5-HT e da dinâmica das piscinas vesícula. Temas dizem respeito aos princípios fundamentais da transmissão sináptica relevantes para todos os sistemas neural.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Mr. Craig D. Slaven (Departamento de Inglês da Universidade de Kentucky) para obter assistência editorial. Apoiada pela Universidade de Kentucky, Departamento de Biologia, Instituto de Estudos de Graduação e Faculdade de Artes e Ciências.