Ensaio de formação de colônia de ágar macio: um método para testar efeitos de novos compostos na proliferação de células cancerosas

1. Preparação de 3% 2-Hidroxietila Agarose

1. Em uma garrafa de vidro limpa e seca de 100 ml, adicione 0,9 g de 2-hidroxietila agarose (Agarose VII) seguido por 30 ml de água destilada.
2. Micro-ondas a mistura por 15 segundos e redemoinho suavemente. Repita este passo pelo menos mais três vezes até que o pó de agarose se dissolva completamente.
3. Autoclave a garrafa contendo solução por 15 minutos.
4. Permita que a solução agarose esfrie para RT antes de usar mais. Armazene a solução na RT.

2. Preparação da Camada Inferior: 0,6% Gel Agarose

1. Pré-aqueça várias pipetas de 5 ml e 10 ml em uma incubadora de 37 °C para evitar que a agarose se solidifique na pipeta durante o manuseio.
2. Solte parcialmente a tampa da garrafa e micro-ondas a solução de 3% de hidroxietila agarose por 15 segundos. Em seguida, gire suavemente a solução e micro-ondas por mais 15 segundos.
   ATENÇÃO: Tenha cuidado ao rodar a solução agarose porque a solução surge quando exposta ao ar e pode transbordar.
3. Se houver gel sólido residual na garrafa, micro-ondas por mais alguns segundos.
4. Mantenha a garrafa contendo a solução agarose em um banho de água de 45 °C durante os próximos passos para evitar que a solução agarose se solidifique prematuramente.
5. Mídia quente MCF10DCIS em um banho de água de 37 °C.
   NOTA: A mídia MCF10DCIS consiste em DMEM/F12, 5% soro de cavalo, 5% estreptomicina de penicilina.
6. Transfira 3 ml da solução de 3% de agarose usando as pipetas pré-aquecidas em um tubo cônico estéril de 50 ml.
7. Adicione imediatamente 12 ml de mídia MCF10DCIS quente e inverta suavemente o tubo cônico para misturar a agarose com a mídia. Tente não formar bolhas, pois vai interferir com a contagem da colônia mais tarde.
8. Adicione suavemente 2 ml desta mistura em cada poço de uma placa de cultura de 6 poços sem formar bolhas de ar.
9. Incubar a placa de cultura de 6 poços horizontalmente em uma superfície plana a 4 °C por 1 hora para permitir que a mistura se solidifique.
10. Depois que a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C por 30 min. A camada inferior está agora pronta para uso.

3. Preparação da camada contendo células: 0,3% Gel Agarose

1. Experimentpsinize as células MCF10DCIS e dilua-as a uma concentração celular de 4 x 10⁴ /ml.
2. Tome 2 ml da 3% de agarose usando pipetas pré-aquecidas e transfira para um tubo cônico estéril de 50 ml.
3. Adicione imediatamente 8 ml de mídia MCF10DCIS ao tubo cônico e inverta suavemente para misturar a agarose com a mídia. Evite formar bolhas.
4. Pegue 2 ml das células MCF10DCIS (4 x 10⁴ /ml) e trate com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
5. Em uma diluição de 1:1, misture as células com a ágarose de 0,6%.
6. Pegue 1 ml da mistura de agarose celular e adicione suavemente a camada inferior da placa de cultura de 6 poços (2 x 10⁴ células/ml).
7. Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana a 4 °C por pelo menos 15 minutos para permitir que a camada superior se solidifique.
8. Depois que a mistura se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C durante uma semana antes de adicionar a camada de alimentação.

4. Preparação da camada alimentador: 0,3% Gel Agarose

1. Micro-ondas a solução pré-fabricada 3% 2-Hidroxiethyl agarose por 15 segundos. suavemente redemoinho a solução e micro-ondas por mais 15 segundos.
2. Equilibre a garrafa de solução de agarose em um banho de água de 45 °C.
3. Aqueça a mídia MCF10DCIS em um banho de água de 37 °C.
4. Misture 1 ml de solução de 3% de agarose com 9 ml de mídia MCF10DCIS quente em um tubo cônico de 50 ml e inverta suavemente para misturar a ágarose com a mídia. Evite formar bolhas de ar.
5. Trate a mistura com BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
6. Adicione suavemente 1 ml desta mistura (sem formar bolhas) em cada poço da placa de cultura de 6 poços contendo as camadas inferior e macia.
7. Coloque a placa de cultura de 6 poços horizontalmente sobre uma superfície plana a 4 °C por pelo menos 15 minutos para permitir que a mistura se solidifique.
8. Depois que a camada de alimentador se solidificar, coloque a placa em uma incubadora de 37 °C.
9. Repita este procedimento alimentar semanalmente sobrepondo 1 ml de 0,3% de solução de agarose/meio/tratamento na camada alimentador existente para repor as células com novas mídias até que a formação da colônia seja observada.
   NOTA: Ágar nas camadas macias e alimentador é muito macio e, portanto, os nutrientes adicionados da camada alimentador facilmente difundirão na camada contendo células para alcançar as células.