软阿加结肠形成分析：一种测试新颖化合物对癌细胞增殖影响的方法

1. 准备 3% 2- 羟基阿加罗斯

1. 放入干净干燥的 100 毫升玻璃瓶中，加入 0.9 克 2 羟基蔗糖（Agarose VII），然后加入 30 毫升蒸馏水。
2. 微波混合物15秒，轻轻旋转。重复此步骤至少三次，直到阿加罗斯粉完全溶解。
3. 将含溶液的瓶子自动封装 15 分钟。
4. 允许阿加罗斯解决方案冷却到 RT， 然后再进一步使用。在 RT 中存储解决方案。

2. 底部层的准备： 0.6% 阿加罗斯凝胶

1. 在 37 °C 孵化器中预热几个 5 毫升和 10 毫升移液器，以防止处理时在移液器中凝固 agarose。
2. 部分松开瓶盖，将预制的 3% 2 羟基 agarose 溶液微波加热 15 秒。然后，轻轻旋转溶液和微波炉15秒。
   注意事项： 在旋转阿加罗斯溶液时要小心，因为溶液暴露在空气中时会上升，并可能溢出。
3. 如果瓶子里有残留的固体凝胶，微波炉再加热几秒钟。
4. 在接下来的步骤中，将含有蔗糖溶液的瓶子保存在 45 °C 的水浴中，以防止蔗糖溶液过早凝固。
5. 在 37 °C 的水浴中加热 MCF10DCIS 介质。
   注： MCF10DCIS介质由DMEM/F12、5%马血清、5%青霉素链霉素组成。
6. 使用预热移液将 3 毫升 3% 的 agarose 溶液转移到无菌 50 毫升圆锥管中。
7. 立即添加 12 毫升温暖的 MCF10DCIS 介质，并轻轻地倒置圆锥管，将蔗糖与介质混合。尽量不要形成任何气泡，因为它会干扰以后的殖民地计数。
8. 在不形成任何气泡的情况下，将2毫升这种混合物加入6井培养板的每口井中。
9. 在 4 °C 的平面上水平孵育 6 井培养板 1 小时，使混合物凝固。
10. 混合物凝固后，将盘子放入 37 °C 的孵化器中 30 分钟。底部层现已准备就绪，可以使用。

3. 准备含细胞层： 0.3% 阿加罗斯凝胶

1. 尝试对MCF10DCIS细胞进行脱脂，并稀释到4 x 10^4/ml的细胞浓度。
2. 使用预热移液器服用 3% 的 agarose 的 2 毫升，并转移到无菌的 50 毫升圆锥管中。
3. 立即将 8 毫升 MCF10DCIS 介质添加到圆锥管中，然后轻轻地倒置，将 agarose 与介质混合。避免形成任何气泡。
4. 服用2毫升MCF10DCIS细胞（4 x 10^4/ml），用BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM治疗。
5. 在 1：1 稀释中，将细胞与 0.6% 的 agarose 混合。
6. 取1毫升的细胞-糖混合物，轻轻地添加到6井培养板的底层（2 x 10⁴细胞/毫升）。
7. 将 6 井培养板水平放置在 4 °C 的平面上至少 15 分钟，以便顶部层凝固。
8. 混合物凝固后，将盘子放入 37 °C 孵化器中一周，然后再添加喂食层。

4. 准备喂食层： 0.3% 阿加罗斯凝胶

1. 微波预制的3%2-羟基糖溶液15秒，轻轻旋转溶液，微波再旋转15秒。
2. 在 45 °C 的水浴中平衡 agarose 溶液瓶。
3. 在 37 °C 的水浴中加热 MCF10DCIS 介质。
4. 将 1 毫升 3% 的蔗糖溶液与 9 毫升温暖的 MCF10DCIS 介质混合到 50 毫升圆锥管中，轻轻倒置，将蔗糖与介质混合。避免形成气泡。
5. 用BB-CLA（0μM（DMSO）或1μM治疗混合物。
6. 将1毫升这种混合物（不形成气泡）轻轻加入包含底部和软层的6井培养板的每口井中。
7. 将 6 井培养板水平放置在 4 °C 的平面上至少 15 分钟，使混合物凝固。
8. 支线层凝固后，将板放入 37 °C 孵化器中。
9. 每周重复此喂食过程，将 1 毫升 0.3% 的 agarose/中/处理溶液叠加到现有的喂食层上，以新介质补充细胞，直到观察到菌落形成。
   注： 软层和喂食层中的 Agar 非常柔软，因此，来自喂料层的添加营养物质很容易扩散到含细胞层中以到达细胞。