Soft Agar Colony Formation Assay: Une méthode pour tester les effets de nouveaux composés sur la prolifération des cellules cancéreuses

1. Préparation de 3% 2-Hydroxyethyl Agarose

1. Dans une bouteille en verre propre et sèche de 100 ml, ajouter 0,9 g d’agarose 2 hydroxyéthyle (Agarose VII) suivie de 30 ml d’eau distillée.
2. Cuire le mélange au micro-ondes pendant 15 secondes et tourbillonner doucement. Répétez cette étape au moins trois fois de plus jusqu’à ce que la poudre d’agarose se dissolve complètement.
3. Autoclave la bouteille contenant des solutions pendant 15 min.
4. Laissez refroidir la solution agarose à RT avant d’en utiliser davantage. Stockez la solution chez RT.

2. Préparation de la couche inférieure: 0,6% Gel Agarose

1. Préchauffer plusieurs pipettes de 5 ml et 10 ml dans un incubateur de 37 °C pour empêcher l’agarose de se solidifier dans la pipette lors de la manipulation.
2. Relâchez partiellement le couvercle de la bouteille et micro-ondes la solution d’agarose pré-faite 3% 2 hydroxyethyl pendant 15 sec. Puis, faites pivoter doucement la solution et micro-ondes pendant encore 15 sec.
   MISE EN GARDE: Soyez prudent lorsque vous tourbillonnez la solution agarose parce que la solution se lève lorsqu’elle est exposée à l’air et peut déborder.
3. S’il y a du gel solide résiduel dans la bouteille, cuire au micro-ondes pendant encore quelques secondes.
4. Gardez la bouteille contenant la solution agarose dans un bain d’eau de 45 °C pendant les prochaines étapes pour empêcher la solution agarose de se solidifier prématurément.
5. Réchauffer les supports MCF10DCIS dans un bain d’eau de 37 °C.
   REMARQUE: McF10DCIS media se compose de DMEM/F12, 5% sérum de cheval, 5% streptomycine de pénicilline.
6. Transférer 3 ml de la solution agarose à 3 % à l’aide des pipettes préchauffées dans un tube conique stérile de 50 ml.
7. Ajouter immédiatement 12 ml de supports MCF10DCIS chauds et inverser délicatement le tube conique pour mélanger l’agarose avec le média. Essayez de ne pas former de bulles car cela interférera avec le comptage de la colonie plus tard.
8. Ajouter délicatement 2 ml de ce mélange dans chaque puits d’une plaque de culture de 6 puits sans former de bulles d’air.
9. Incuber la plaque de culture de 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant 1 heure pour permettre au mélange de se solidifier.
10. Après que le mélange se solidifie, placer la plaque dans un incubateur de 37 °C pendant 30 min. La couche inférieure est maintenant prête à l’emploi.

3. Préparation de la couche contenant des cellules : 0,3 % Gel d’Agarose

1. Essayez les cellules MCF10DCIS et diluez-les à une concentration cellulaire de 4 x 10^4/ml.
2. Prendre 2 ml de l’agarose de 3 % à l’aide de pipettes préchauffées et transférer dans un tube conique stérile de 50 ml.
3. Ajouter immédiatement 8 ml de supports MCF10DCIS au tube conique et inverser doucement pour mélanger l’agarose avec les médias. Évitez de former des bulles.
4. Prendre 2 ml des cellules MCF10DCIS (4 x 10^4/ml) et traiter avec BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
5. Dans une dilution 1:1, mélanger les cellules avec l’agarose de 0,6%.
6. Prendre 1 ml du mélange cellule-agarose et ajouter délicatement sur la couche inférieure de la plaque de culture de 6 puits (2 x 10⁴ cellules/ml).
7. Placez la plaque de culture de 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant au moins 15 min pour permettre à la couche supérieure de se solidifier.
8. Après que le mélange se solidifie, placez l’assiette dans un incubateur de 37 °C pendant une semaine avant d’ajouter la couche d’alimentation.

4. Préparation de la couche d’alimentation : Gel d’agarose de 0,3 %

1. Micro-ondes la solution pré-faite 3% 2-Hydroxyethyl agarose pendant 15 sec. tourbillonnez doucement la solution et micro-ondes pendant encore 15 sec.
2. Equilibrer la bouteille de solution agarose dans un bain d’eau de 45 °C.
3. Réchauffez les supports MCF10DCIS dans un bain d’eau de 37 °C.
4. Mélanger 1 ml de solution d’agarose à 3 % avec 9 ml de supports MCF10DCIS chauds dans un tube conique de 50 ml et inverser délicatement pour mélanger l’agarose avec le média. Évitez de former des bulles d’air.
5. Traiter le mélange avec BB-CLA (0 μM (DMSO) ou 1 μM).
6. Ajouter délicatement 1 ml de ce mélange (sans former de bulles) dans chaque puits de la plaque de culture de 6 puits contenant les couches inférieures et molles.
7. Placer la plaque de culture de 6 puits horizontalement sur une surface plane à 4 °C pendant au moins 15 minutes pour permettre au mélange de se solidifier.
8. Une fois que la couche d’alimentation se solidifie, placez la plaque dans un incubateur de 37 °C.
9. Répétez cette procédure d’alimentation chaque semaine en superposant 1 ml de solution d’agarose/moyen/traitement de 0,3 % sur la couche d’alimentation existante pour reconstituer les cellules avec de nouveaux médias jusqu’à ce que la formation de la colonie soit observée.
   REMARQUE: L’agar dans les couches molles et d’alimentation est très doux et, par conséquent, les éléments nutritifs ajoutés de la couche d’alimentation se diffuseront facilement dans la couche contenant des cellules pour atteindre les cellules.