Ce protocole vise à plaquer de manière stable des assembloïdes fusionnés dorsaux-ventraux sur des réseaux multi-électrodes pour modéliser l’épilepsie in vitro.
Les organoïdes du cerveau humain sont des structures tridimensionnelles (3D) dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui récapitulent des aspects du développement du cerveau fœtal. La fusion in vitro d’organoïdes cérébraux dorsaux avec des organoïdes cérébraux spécifiés localement génère des assembloïdes, qui ont des microcircuits fonctionnellement intégrés avec des neurones excitateurs et inhibiteurs. En raison de leur complexité structurelle et de la diversité de leur population de neurones, les assembloïdes sont devenus un outil in vitro utile pour étudier l’activité aberrante des réseaux. Les enregistrements multi-électrodes (MEA) servent de méthode pour capturer les potentiels de champ électrique, les pointes et la dynamique de réseau longitudinale d’une population de neurones sans compromettre l’intégrité de la membrane cellulaire. Cependant, il peut être difficile de faire adhérer des assembloïdes sur les électrodes pour des enregistrements à long terme en raison de leur grande taille et de leur surface de contact limitée avec les électrodes. Ici, nous démontrons une méthode permettant de plaquer des assembloïdes sur des plaques MEA pour enregistrer l’activité électrophysiologique sur une période de 2 mois. Bien que le protocole actuel utilise des organoïdes corticaux humains, il peut être largement adapté à des organoïdes différenciés pour modéliser d’autres régions du cerveau. Ce protocole établit un test électrophysiologique longitudinal robuste pour étudier le développement d’un réseau neuronal, et cette plateforme a le potentiel d’être utilisée dans le criblage de médicaments pour le développement thérapeutique dans l’épilepsie.
Les organoïdes cérébraux dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont des structures 3D spatialement auto-organisées reflétant l’architecture tissulaire et les trajectoires de développement in vivo. Ils sont composés de plusieurs types de cellules, y compris des progéniteurs (cellules neuroépithéliales, glie radiale, progéniteurs neuronaux, progéniteurs gliaux), des neurones (neurones excitateurs de type cortical et interneurones inhibiteurs) et des cellules gliales (astrocytes et oligodendrocytes)1,2. Les assembloïdes représentent la prochaine génération d’organoïdes cérébraux, capables d’intégrer plusieurs régions cérébrales et/ou lignées cellulaires au sein d’une culture 3D. Ils constituent un outil utile pour modéliser les connexions entre diverses régions du cerveau ressemblant à leurs homologues in vivo, capturer les interactions entre les neurones et les astrocytes afin de mieux imiter les réseaux neuronaux matures et complexes, et pour étudier l’assemblage des circuits neuronaux. Par conséquent, les assembloïdes deviennent un outil largement utilisé pour récapituler les caractéristiques de la physiopathologie de l’épilepsie, dans laquelle des mesures fonctionnelles sont nécessaires pour interroger les réseaux neuronaux aberrants qui peuvent être à l’origine dela maladie.
Pour modéliser les interactions entre les neurones glutamatergiques corticaux et les interneurones GABAergiques, plusieurs groupes ont développé des organoïdes séparés ressemblant au cerveau dorsal et ventral, puis les ont fusionnés en un assembloïde multi-régions 7,8,9,10. Ici, un protocole de culture assembloïde précédemment décrit avec des sous-types neuronaux spécifiques à la région a été appliqué9. Cependant, un obstacle important est le manque de tests fonctionnels reproductibles pour surveiller l’activité du réseau neuronal pendant le développement neurologique. De nombreux tests fonctionnels des réseaux dans les organoïdes donnent des résultats qui présentent une grande variabilité entre les lots de différenciations et les lignées cellulaires. Les techniques qui impliquent de trancher ou de dissocier des organoïdes modifient leurs réseaux inhérents en coupant la connectivité synaptique8.
Les réseaux multi-électrodes (MEA) fournissent une vue à grande échelle de l’activité du réseau au fil du temps avec une résolution temporelle élevée pour caractériser les propriétés électrophysiologiques des organoïdes sans perturber les conditions de culture ou l’intégrité de la membrane cellulaire11. Par rapport à l’électrophysiologie par patch clamp, la MEA permet l’acquisition de données à haut débit basée sur de grandes populations de neurones plutôt que sur des cellules uniques. Les plates-formes MEA varient dans leur densité d’électrodes, répondant à différents besoins dans la recherche sur les organoïdes cérébraux12. Les systèmes largement utilisés, comme le montre ce protocole, enregistrent de 8 à 64 électrodes par puits 13,14,15. Les MEA à haute densité avec jusqu’à 26 400 électrodes par puits permettent d’augmenter la résolution spatiale et temporelle, la quantification de la vitesse de propagation du potentiel d’action et la combinaison avec la stimulation optogénétique 14,16,17. Par conséquent, la MEA sert d’outil puissant pour la modélisation de l’épilepsie in vitro et de paradigme translationnel pour le dépistage des médicaments anti-épileptiques.
L’un des principaux défis consiste à stabiliser les assembloïdes de grande taille sur une surface métallique hydrophobe pour des enregistrements à long terme. Ce protocole décrit une méthodologie détaillée pour le placage d’assembloïdes intacts sur des plaques MEA pour un enregistrement longitudinal à long terme ainsi que des tests pharmacologiques. Les avantages uniques du protocole comprennent une fixation stable des assembloïdes à la surface de l’électrode sans perte d’activité électrique, l’utilisation de milieux neurophysiologiques basaux disponibles dans le commerce pour accélérer la maturation du réseau fonctionnel après le placage, la possibilité d’effectuer des tests fonctionnels en aval comme le traitement médicamenteux et une large application aux organoïdes générés avec d’autres protocoles spécifiques à une région.
L’objectif est de fournir un test fonctionnel à haute résolution temporelle pour étudier l’activité du réseau, examiner les changements spécifiques à la maladie et tester des médicaments ayant un potentiel thérapeutique dans l’épilepsie. Des instructions vidéo sont fournies pour les étapes les plus difficiles de ce protocole, montrant les techniques de placage des assembloïdes sur des plaques MEA, ainsi que des enregistrements représentatifs de ces cultures.
Des méthodes basées sur la MEA pour l’enregistrement électrophysiologique de l’activité du réseau dans des assembloïdes dérivés d’iPSC ont été utilisées pour la modélisation in vitro de l’épilepsie22,23. Cette plateforme proposée intégrant des connexions synaptiques excitatrices et inhibitrices a le potentiel d’aborder les mécanismes de l’hyperexcitabilité neuronale et le rôle des interneuro…
The authors have nothing to disclose.
Ce manuscrit a été soutenu par R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). La figure 1 a été générée à l’aide de biorender.com.
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes | Corning | 08-772-32 | For suspension culture on the shaker |
100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Working concentration 100 μM |
48-well cell culture plate | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
6-well cell culture plate | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
Allopregnanolone | Cayman | 16930 | Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM. |
Automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
Axion CytoView MEA 6-well plates | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
Axion Maestro MEA platform | Axion Biosystems | Maestro | With temp environmental control |
B-27 supplement (regular, with Vitamin A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
B-27 supplement (without Vitamin A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
Basement membrane matrix- Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
Bead bath | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
Benchtop inverted microscope | Olympus | CKX53 | Kept in laminar flow clean bench |
Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Working concentration 10 μM |
Bleach | CLOROX | 67619-26 | |
Borate buffer 20x | Thermo Fisher | 28341 | Working concentration at 1x |
BrainPhys media | StemCell Technologies | 5790 | |
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
Celltron orbital shaker | HT-Infors | I69222 | |
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine | Thermo Fisher | 113300 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM) |
D-PBS w/o calcium or magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Hemacytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
Humidity controlled cell culture incubator | Thermo Fisher | 370 | set to 37 °C, 5% CO2 |
IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use. |
Knockout serum replacement (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
mTeSRplus (medium + supplements) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Penicilin/Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Pipette (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection |
Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript. |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-200 | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM). |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 from 10 mM stock |
SAG (smoothened agonist) | Selleckchem | S7779 | Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM). |
SB-431542 | Tocris | 1614 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM) |
Serological pipette filler | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
Steriflip vacuum tube top filter | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
Zoom stereomicroscope | Olympus | SZ61/SZ51 | Kept in laminar flow clean bench |