Dieses Protokoll zielt darauf ab, dorsal-ventral fusionierte Assembloide auf Mehrelektrodenarrays stabil zu plädieren, um die Epilepsie in vitro zu modellieren.
Organoide des menschlichen Gehirns sind dreidimensionale (3D) Strukturen, die von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) abgeleitet sind und Aspekte der Entwicklung des fetalen Gehirns rekapitulieren. Die Fusion von dorsalen mit ventral regional spezifizierten Hirnorganoiden in vitro erzeugt Assembloide, die funktionell integrierte Mikroschaltkreise mit exzitatorischen und inhibitorischen Neuronen aufweisen. Aufgrund ihrer strukturellen Komplexität und der vielfältigen Population von Neuronen sind Assembloide zu einem nützlichen In-vitro-Werkzeug für die Untersuchung aberranter Netzwerkaktivität geworden. Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungen (MEA) dienen als Methode zur Erfassung von elektrischen Feldpotentialen, Spitzen und longitudinaler Netzwerkdynamik von einer Population von Neuronen, ohne die Integrität der Zellmembran zu beeinträchtigen. Das Aufkleben von Assembloiden auf die Elektroden für Langzeitaufzeichnungen kann jedoch aufgrund ihrer Größe und der begrenzten Kontaktfläche mit den Elektroden eine Herausforderung darstellen. Hier demonstrieren wir eine Methode zur Platte von Assembloiden auf MEA-Platten zur Aufzeichnung der elektrophysiologischen Aktivität über einen Zeitraum von 2 Monaten. Obwohl das derzeitige Protokoll menschliche kortikale Organoide verwendet, kann es weitgehend an Organoide angepasst werden, die differenziert werden, um andere Gehirnregionen zu modellieren. Dieses Protokoll etabliert einen robusten, longitudinalen, elektrophysiologischen Assay zur Untersuchung der Entwicklung eines neuronalen Netzwerks, und diese Plattform hat das Potenzial, im Wirkstoffscreening für die therapeutische Entwicklung bei Epilepsie eingesetzt zu werden.
Aus humanen pluripotenten Stammzellen (hPSC) gewonnene Hirnorganoide sind räumlich selbstorganisierte 3D-Strukturen, die die Gewebearchitektur und Entwicklungsverläufe in vivo widerspiegeln. Sie setzen sich aus mehreren Zelltypen zusammen, darunter Vorläuferzellen (Neuroepithelzellen, radiale Gliazellen, neuronale Vorläuferzellen, gliale Vorläuferzellen), Neuronen (kortikal-ähnliche exzitatorische Neuronen und inhibitorische Interneuronen) und Gliazellen (Astrozyten und Oligodendrozyten)1,2. Assembloide stellen die nächste Generation von Gehirn-Organoiden dar, die in der Lage sind, mehrere Gehirnregionen und/oder Zelllinien in eine 3D-Kultur zu integrieren. Sie bieten ein nützliches Werkzeug für die Modellierung von Verbindungen zwischen verschiedenen Gehirnregionen, die den In-vivo-Gegenstücken ähneln, für die Erfassung von Interaktionen zwischen Neuronen und Astrozyten, um ausgereifte und komplexe neuronale Netzwerke besser nachzuahmen, und für die Untersuchung des Aufbaus neuronaler Schaltkreise. Daher werden Assembloide zu einem weit verbreiteten Werkzeug zur Rekapitulation von Kennzeichen der Epilepsie-Pathophysiologie, bei der funktionelle Maßnahmen erforderlich sind, um aberrante neuronale Netzwerke zu untersuchen, die der Ursache der Krankheit zugrunde liegen können 3,4,5,6.
Um die Wechselwirkungen zwischen kortikalen glutamatergen Neuronen und GABAergen Interneuronen zu modellieren, entwickelten mehrere Gruppen separate Organoide, die dem dorsalen und ventralen Gehirn ähneln, und verschmolzen sie dann zu einem Multiregionen-Assembloid 7,8,9,10. Hier wurde ein zuvor beschriebenes Assembloid-Kulturprotokoll mit regional spezifischen neuronalen Subtypen angewendet9. Ein wesentliches Hindernis ist jedoch der Mangel an reproduzierbaren funktionellen Assays zur Überwachung der Aktivität neuronaler Netzwerke während der Neuroentwicklung. Viele Funktionstests der Netzwerke in Organoiden liefern Ergebnisse, die eine hohe Variabilität zwischen Chargen von Differenzierungen und Zelllinien aufweisen. Techniken, bei denen Organoide in Scheiben geschnitten oder dissoziiert werden, verändern ihre inhärenten Netzwerke, indem sie die synaptische Konnektivität unterbrechen8.
Multi-Elektroden-Arrays (MEA) bieten einen großräumigen Überblick über die Netzwerkaktivität im Zeitverlauf mit hoher zeitlicher Auflösung, um die elektrophysiologischen Eigenschaften von Organoiden zu charakterisieren, ohne die Kulturbedingungen oder die Integrität der Zellmembran zu stören11. Im Vergleich zur Patch-Clamp-Elektrophysiologie ermöglicht MEA eine Hochdurchsatz-Datenerfassung auf der Grundlage großer Populationen von Neuronen anstelle einzelner Zellen. MEA-Plattformen variieren in ihrer Elektrodendichte und decken unterschiedliche Bedürfnisse in der Hirnorganoidforschung ab12. Die weit verbreiteten Systeme, wie in diesem Protokoll gezeigt, zeichnen zwischen 8 und 64 Elektroden pro Vertiefungauf 13,14,15. MEAs mit hoher Dichte und bis zu 26.400 Elektroden pro Vertiefung ermöglichen eine erhöhte räumliche und zeitliche Auflösung, die Quantifizierung der Ausbreitungsgeschwindigkeit des Aktionspotentials und die Kombination mit optogenetischer Stimulation 14,16,17. Daher dient MEA als leistungsfähiges Werkzeug für die Modellierung von Epilepsie in vitro und als translationales Paradigma für das Screening von Medikamenten gegen Krampfanfälle.
Eine große Herausforderung besteht darin, die großformatigen Assembloide auf einer hydrophoben Metalloberfläche für Langzeitaufnahmen zu stabilisieren. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methodik für die Beschichtung intakter Assembloide auf MEA-Platten für die Langzeit-Längsschnittaufzeichnung zusammen mit pharmakologischen Assays. Zu den einzigartigen Vorteilen des Protokolls gehören die stabile Befestigung von Assembloiden an der Elektrodenoberfläche ohne Verlust der elektrischen Aktivität, die Verwendung kommerziell erhältlicher neurophysiologischer Basalmedien zur Beschleunigung der Reifung des funktionellen Netzwerks nach der Beschichtung, die Machbarkeit der Durchführung nachgelagerter funktioneller Assays wie der Arzneimittelbehandlung und die breite Anwendung auf Organoide, die mit anderen regionenspezifischen Protokollen erzeugt wurden.
Ziel ist es, einen funktionellen Assay mit hoher zeitlicher Auflösung zur Verfügung zu stellen, um die Netzwerkaktivität zu untersuchen, krankheitsspezifische Veränderungen zu untersuchen und Medikamente mit therapeutischem Potenzial bei Epilepsie zu testen. Für die anspruchsvollsten Schritte dieses Protokolls werden Videoanweisungen bereitgestellt, die die Techniken zum Plattieren von Assembloiden auf MEA-Platten sowie repräsentative Aufnahmen aus diesen Kulturen zeigen.
MEA-basierte Methoden zur elektrophysiologischen Aufzeichnung der Netzwerkaktivität in iPSC-abgeleiteten Assembloiden wurden für die in vitro Modellierung von Epilepsie verwendet22,23. Diese vorgeschlagene Plattform, die exzitatorische und inhibitorische synaptische Verbindungen integriert, hat das Potenzial, Mechanismen der neuronalen Übererregbarkeit und die Rolle kortikaler Interneurone im Prozess der Epileptogenes…
The authors have nothing to disclose.
Dieses Manuskript wurde unterstützt von R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). Abbildung 1 wurde mit biorender.com generiert.
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes | Corning | 08-772-32 | For suspension culture on the shaker |
100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Working concentration 100 μM |
48-well cell culture plate | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
6-well cell culture plate | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
Allopregnanolone | Cayman | 16930 | Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM. |
Automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
Axion CytoView MEA 6-well plates | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
Axion Maestro MEA platform | Axion Biosystems | Maestro | With temp environmental control |
B-27 supplement (regular, with Vitamin A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
B-27 supplement (without Vitamin A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
Basement membrane matrix- Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
Bead bath | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
Benchtop inverted microscope | Olympus | CKX53 | Kept in laminar flow clean bench |
Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Working concentration 10 μM |
Bleach | CLOROX | 67619-26 | |
Borate buffer 20x | Thermo Fisher | 28341 | Working concentration at 1x |
BrainPhys media | StemCell Technologies | 5790 | |
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
Celltron orbital shaker | HT-Infors | I69222 | |
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine | Thermo Fisher | 113300 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM) |
D-PBS w/o calcium or magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Hemacytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
Humidity controlled cell culture incubator | Thermo Fisher | 370 | set to 37 °C, 5% CO2 |
IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use. |
Knockout serum replacement (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
mTeSRplus (medium + supplements) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Penicilin/Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Pipette (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection |
Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript. |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-200 | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM). |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 from 10 mM stock |
SAG (smoothened agonist) | Selleckchem | S7779 | Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM). |
SB-431542 | Tocris | 1614 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM) |
Serological pipette filler | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
Steriflip vacuum tube top filter | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
Zoom stereomicroscope | Olympus | SZ61/SZ51 | Kept in laminar flow clean bench |