このプロトコルは、 in vitroでてんかんをモデル化するための多電極アレイ上の背腹融合アッサンブロイドを安定してプレートすることを目的としています。
ヒト脳オルガノイドは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する三次元(3D)構造で、胎児の脳の発達の側面を再現しています。 in vitro で背側と腹側領域に特異的な脳オルガノイドを融合させると、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンと機能的に統合されたマイクロ回路を持つアセンブロイドが生成されます。アッセンブロイドは、その構造の複雑さと多様なニューロン集団により、異常なネットワーク活動を研究するための有用な in vitro ツールとなっています。マルチ電極アレイ(MEA)記録は、細胞膜の完全性を損なうことなく、ニューロン集団からの電場電位、スパイク、および縦方向のネットワークダイナミクスを捕捉する方法として機能します。しかし、長期間の記録のためにアッセンブロイドを電極に接着することは、サイズが大きく、電極との接触表面積が限られているため、困難な場合があります。ここでは、2ヶ月間にわたる電気生理学的活動を記録するために、MEAプレート上にアッサンブロイドをプレート化する方法を示します。現在のプロトコルはヒト皮質オルガノイドを利用していますが、他の脳領域をモデル化するために分化したオルガノイドに広く適応させることができます。このプロトコルは、ニューロンネットワークの発達を研究するための堅牢で縦断的な電気生理学的アッセイを確立し、このプラットフォームはてんかんの治療開発のための薬物スクリーニングに使用される可能性を秘めています。
ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の脳オルガノイドは、生体内の組織構造と発生過程を反映した空間的に自己組織化された3D構造です。それらは、前駆細胞(神経上皮細胞、放射状グリア、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞)、ニューロン(皮質様興奮性ニューロンおよび抑制性介在ニューロン)、およびグリア細胞(アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト)1,2を含む複数の細胞タイプで構成されています。アッセンブロイドは、3D培養内で複数の脳領域や細胞系統を統合することができる次世代の脳オルガノイドです。これらは、in vivoの対応する領域に似たさまざまな脳領域間の接続をモデル化し、ニューロンとアストロサイト間の相互作用を捕捉して成熟した複雑な神経ネットワークをよりよく模倣し、神経回路の組み立てを研究するための有用なツールを提供します。したがって、アッセンブロイドは、てんかんの病態生理学の特徴を再現するために広く使用されているツールになりつつあり、疾患の原因の根底にある可能性のある異常な神経ネットワークを調査するために機能的な手段が必要です3,4,5,6。
皮質グルタミン酸作動性ニューロンとGABA作動性介在ニューロンとの間の相互作用をモデル化するために、いくつかのグループが背側と腹側の脳に似た別々のオルガノイドを開発し、それらを融合させて多領域集合体7,8,9,10を作りました。ここでは、地域特異的な神経サブタイプを有する前述のアッサンブロイド培養プロトコルを適用した9。しかし、大きな障壁は、神経発達中のニューラルネットワーク活動を監視するための再現性のある機能アッセイがないことです。オルガノイドのネットワークの多くの機能試験では、分化のバッチや細胞株間で高いばらつきを持つ結果が得られます。オルガノイドをスライスまたは解離する技術は、シナプスの結合性を切断することにより、オルガノイドの固有のネットワークを変化させます8。
マルチ電極アレイ(MEA)は、培養条件や細胞膜の完全性を乱すことなく、オルガノイドの電気生理学的特性を特徴付けるために、高い時間分解能でネットワーク活動の経時的な大規模なビューを提供します11。パッチクランプ電気生理学と比較して、MEAは、単一細胞ではなく、ニューロンの大規模な集団に基づくハイスループットデータ取得を可能にします。MEAプラットフォームは電極密度が異なり、脳オルガノイド研究のさまざまなニーズに対応しています12。このプロトコルで示されているように、広く使用されているシステムは、ウェルあたり8〜64個の電極を記録します13,14,15。ウェルあたり最大26,400個の電極を備えた高密度MEAにより、空間分解能と時間分解能の向上、活動電位伝搬速度の定量化、および光遺伝学的刺激14,16,17との組み合わせが可能になります。したがって、MEAは、in vitroでてんかんをモデル化するための強力なツールであり、抗てんかん薬スクリーニングのトランスレーショナルパラダイムとして機能します。
大きな課題の1つは、長期記録のために疎水性金属表面で大型アッセンブロイドを安定させることです。このプロトコールでは、薬理学的アッセイとともに長期の縦断的記録のために、無傷のアッサンブロイドをMEAプレートにプレーティングするための詳細な方法論を概説しています。このプロトコルのユニークな利点には、電気的活性を失うことなくアッサンブロイドを電極表面に安定して付着させること、プレーティング後の機能ネットワークの成熟を促進するための市販の神経生理学的基礎媒体の使用、薬物治療のような下流の機能アッセイの実施可能性、および他の領域特異的プロトコルで生成されたオルガノイドへの広範な適用が含まれます。
目標は、てんかんにおけるネットワーク活性の調査、疾患特異的な変化の検討、および治療可能な可能性のある薬剤の試験を行うための、高い時間分解能を持つ機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、MEAプレートにアセンブロイドをめっきする技術と、これらの培養物からの代表的な記録を示すビデオ説明が提供されています。
iPS細胞由来アッサンブロイドにおけるネットワーク活性の電気生理学的記録のためのMEAベースの方法は、てんかんのin vitroモデリングに使用されてきました22,23。興奮性シナプス結合と抑制性シナプス結合を統合したこの提案されたプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズムと、てんかん発生の過程に…
The authors have nothing to disclose.
この原稿はR01NS127829 NIH/NINDS (LTD) の支援を受けました。 図 1 は biorender.com を使用して生成されています。
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes | Corning | 08-772-32 | For suspension culture on the shaker |
100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Working concentration 100 μM |
48-well cell culture plate | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
6-well cell culture plate | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
Allopregnanolone | Cayman | 16930 | Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM. |
Automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
Axion CytoView MEA 6-well plates | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
Axion Maestro MEA platform | Axion Biosystems | Maestro | With temp environmental control |
B-27 supplement (regular, with Vitamin A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
B-27 supplement (without Vitamin A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
Basement membrane matrix- Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
Bead bath | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
Benchtop inverted microscope | Olympus | CKX53 | Kept in laminar flow clean bench |
Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Working concentration 10 μM |
Bleach | CLOROX | 67619-26 | |
Borate buffer 20x | Thermo Fisher | 28341 | Working concentration at 1x |
BrainPhys media | StemCell Technologies | 5790 | |
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
Celltron orbital shaker | HT-Infors | I69222 | |
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine | Thermo Fisher | 113300 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM) |
D-PBS w/o calcium or magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Hemacytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
Humidity controlled cell culture incubator | Thermo Fisher | 370 | set to 37 °C, 5% CO2 |
IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use. |
Knockout serum replacement (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
mTeSRplus (medium + supplements) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Penicilin/Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Pipette (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection |
Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript. |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-200 | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM). |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 from 10 mM stock |
SAG (smoothened agonist) | Selleckchem | S7779 | Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM). |
SB-431542 | Tocris | 1614 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM) |
Serological pipette filler | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
Steriflip vacuum tube top filter | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
Zoom stereomicroscope | Olympus | SZ61/SZ51 | Kept in laminar flow clean bench |