Bioimpressão Incorporada de Estruturas Semelhantes a Tecidos Usando Meio Submicrogel κ-Carragenana
Summary
Este estudo apresenta um novo banho de suspensão de submicrogel de κ-carragenina, exibindo notáveis propriedades reversíveis de transição de interferência-desobstrução. Esses atributos contribuem para a construção de tecidos e órgãos biomiméticos em bioimpressão 3D embarcada. A impressão bem-sucedida de tecidos semelhantes ao coração/esôfago com alta resolução e crescimento celular demonstra aplicações de bioimpressão e engenharia de tecidos de alta qualidade.
Abstract
A bioimpressão tridimensional (3D) incorporada utilizando um banho de suporte de hidrogel granular surgiu como uma técnica crítica para a criação de andaimes biomiméticos. No entanto, a engenharia de um meio de suspensão de gel adequado que equilibre a deposição precisa de bioink com a viabilidade e função celular apresenta vários desafios, particularmente na obtenção das propriedades viscoelásticas desejadas. Aqui, um novo banho de suporte de gel de κ-carragenina é fabricado por meio de um processo de moagem mecânica fácil de operar, produzindo partículas homogêneas em submicroescala. Esses submicrogéis exibem comportamento típico de fluxo de Bingham com pequena tensão de escoamento e propriedades de afinamento rápido por cisalhamento, que facilitam a deposição suave de bioinks. Além disso, a transição gel-sol reversível e as capacidades de autocura da rede de microgel κ-carragenina garantem a integridade estrutural das construções impressas, permitindo a criação de estruturas de tecido complexas e multicamadas com características arquitetônicas definidas. Após a impressão, os submicrogéis de κ-carragenina podem ser facilmente removidos por uma simples lavagem salina tamponada com fosfato. A bioimpressão adicional com biotintas carregadas de células demonstra que as células dentro das construções biomiméticas têm uma alta viabilidade de 92% e estendem rapidamente os pseudópodes, além de manter uma proliferação robusta, indicando o potencial dessa estratégia de bioimpressão para a fabricação de tecidos e órgãos. Em resumo, este novo meio submicrogel de κ-carragenina surge como um caminho promissor para a bioimpressão incorporada de qualidade excepcional, com profundas implicações para o desenvolvimento in vitro de tecidos e órgãos projetados.
Introduction
Os andaimes de engenharia de tecidos, incluindo fibras eletrofiadas, esponjas porosas e hidrogéis poliméricos, desempenham um papel fundamental no reparo e reconstrução de tecidos e órgãos danificados, fornecendo uma estrutura estrutural que apoia o crescimento celular, a regeneração de tecidos e a restauração da função do órgão 1,2,3. No entanto, os andaimes tradicionais encontram desafios na replicação precisa das estruturas de tecidos nativos, levando a uma incompatibilidade entre os tecidos projetados e naturais. Essa limitação dificulta a cicatrização eficiente de tecidos defeituosos, enfatizando a necessidade urgente de avanços no design de andaimes para obter uma biomimética mais precisa. A bioimpressão tridimensional (3D) é uma técnica de fabricação inovadora que constrói com precisão estruturas complexas de tecidos biológicos camada por camada usando tintas e células de biomateriais4. Entre vários biomateriais, os hidrogéis poliméricos surgem como biotintas ideais com sua rede distinta que facilita o encapsulamento in situ das células e auxilia crucialmente seu crescimento 5,6. No entanto, muitos hidrogéis macios e altamente hidratados tendem a induzir o desfoque ou o rápido colapso das estruturas de andaimes impressas durante o processo de impressão quando usados como biotintas. Para enfrentar esse desafio, a tecnologia de bioimpressão 3D incorporada emprega um banho de microgel como material de suporte, permitindo a deposição precisa de biotinta macia. Após a gelificação das biotintas de hidrogel, andaimes biônicos refinados com estruturas intrincadas são obtidos removendo o banho de microgel. Materiais como gelatina 7,8, agarose9 e goma gelana10,11 foram empregados para criar banhos de microgel para bioimpressão 3D incorporada, avançando significativamente a aplicação de hidrogéis macios na engenharia de tecidos. No entanto, o tamanho de partícula não uniforme e em nível de mícron desses géis particulados afeta negativamente a resolução e a fidelidade da impressão 3D 12,13,14. Há uma necessidade urgente de fabricar um flutuador de suspensão semelhante a gel com partículas pequenas e uniformemente dispersas, oferecendo vantagens na obtenção de bioimpressão de alta fidelidade.
Neste protocolo, um novo banho de suspensão de κ-carragenina granulado sacrificial com um nível uniforme de submícrons é apresentado para impressão 3D incorporada. Este comportamento inovador de banho de submicrogel de transição rápida de interferência-desobstrução facilita a fabricação precisa de andaimes de hidrogel biomiméticos com alta fidelidade estrutural15. Utilizando este novo meio de suspensão, uma série de tecidos biomiméticos e construções de órgãos com estruturas de tecido multicamadas são impressas com sucesso, empregando uma biotinta composta de metacrilato de gelatina e fibrometacrilato de seda. Neste estudo, escolhemos o esôfago como objeto biomimético de bioimpressão 3D principalmente porque o esôfago não apenas possui uma estrutura de tecido multicamadas, mas também sua camada muscular exibe uma estrutura de camadas complexas circulares circulares internas e longitudinais externas. Garantir o alinhamento e a organização adequados dessas camadas é essencial para a regeneração funcional do tecido. Portanto, desejamos muito replicar a arquitetura multicamadas do esôfago. Mais importante, utilizamos submicrogéis de κ-carragenina como banho de suspensão e GelMA / SFMA como biotinta para projetar e construir um andaime biomimético para engenharia de tecidos. O esôfago impresso pode ser facilmente liberado por lavagem salina tamponada com fosfato repetida. Além disso, o banho de κ-carragenina submicrogel é isento de substâncias citotóxicas, garantindo alta citocompatibilidade15. As células musculares lisas carregadas dentro de andaimes anisotrópicos exibem uma notável atividade de disseminação. Este meio de suspensão submicrogel uniforme oferece um novo caminho para a fabricação de tecidos e órgãos complexos por meio de bioimpressão 3D incorporada.
Protocol
Representative Results
Discussion
A preparação de banhos de suspensão de submicrogel de κ-carragenina para uso em bioimpressão é um processo cuidadosamente orquestrado que envolve várias etapas críticas para garantir que o meio resultante exiba as propriedades desejadas para suportar biotintas. Inicialmente, uma solução de κ-carragenina é preparada dissolvendo o pó de κ-carragenina em água deionizada a temperaturas elevadas, criando uma mistura homogênea. A conc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de Ciências Naturais de Ningbo (2022J121, 2023J159), projeto-chave da Fundação de Ciências Naturais da cidade de Ningbo (2021J256), Fundação Aberta do Laboratório Estadual de Engenharia Molecular de Polímeros (Universidade de Fudan) (K2024-35) e Laboratório Chave de Medicina de Precisão para Doenças Ateroscleróticas da Província de Zhejiang, China (2022E10026). Obrigado pelo suporte técnico das Instalações Principais, Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Ningbo.
Materials
| 3D bioprinter | Custom-designed | ||
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole | Solarbio Life Science | C0065 | Ready-to-use |
| 405 nm UV light | EFL | XY-WJ01 | |
| Cell Counter | Corning | Cyto smart 6749 | |
| Confocal laser scanning microscope | Leica | STELLARIS 5 | |
| DMEM high glucose | VivaCell | C3113-0500 | High Glucose, with Sodium Pyruvate and L-Glutamine |
| Dynamic rotational rheometer | TA Instrument | Discovery HR-20 | |
| Esophageal smooth muscle cells | Supplied by the Department of Cell Biology and Regenerative Medicine, Health Science Center, Ningbo University | Primary cells from the rabbit esophagus | |
| Fetal bovine serum | UE | F9070L | |
| Fluorescein isothiocyanate labeled phalloidin | Solarbio Life Science | CA1610 | 300T |
| Gelatin methacrylate | EFL | EFL-GM-60 | 60% substitution |
| k-carrageenan | Aladdin | C121013-100g | Reagent grade |
| Lithium Phenyl (2,4,6-trimethylbenzoyl) phosphinate | Aladdin | L157759-1g | 365~405 nm |
| Live-Dead kit | beyotime | C2015M | |
| Microplate reader | Potenov | PT-3502B | |
| Paraformaldehyde | Solarbio Life Science | P1110 | 4% |
| Penicillin/streptomycin | Solarbio Life Science | MA0110 | 100 ´ |
| Phosphate buffered saline | VivaCell | C3580-0500 | pH 7.2-7.4 |
| Silk fibroin methacrylate | EFL | EFL-SilMA-001 | 39% substitution |
| Triton X-100 | Solarbio Life Science | T8200 | |
| Trypsin-EDTA | VivaCell | C100C1 | 0.25%, without phenol red |
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