Küçük RNA'ları Ölçmek için AQRNA-seq

Büyük paralel dizileme olarak da bilinen yeni nesil dizileme (NGS), DNA parçalanmasını, adaptör oligonükleotidlerin bağlanmasını, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tabanlı amplifikasyonu, DNA’nın dizilenmesini ve parça dizilerinin bir genomda yeniden birleştirilmesini içeren bir DNA dizileme teknolojisidir. NGS’nin RNA dizisine (RNA-dizilimi) adaptasyonu, RNA transkriptlerini ve varyantlarını tanımlamak ve ölçmek için güçlü bir yaklaşımdır¹. RNA kütüphanesi hazırlama iş akışlarındaki ve biyoinformatik analiz boru hatlarındaki yenilikçi gelişmeler, laboratuvar cihazlarındaki ilerlemelerle birleştiğinde, RNA-seq uygulamalarının repertuarını genişletti ve ekzom dizilemenin ötesine geçerek, kodlamayan RNA profillemesi², tek hücre analizi³, uzamsal transkriptomik ^4,5, alternatif birleştirme analizi⁶ gibi gelişmiş fonksiyonel omiklere ilerledi, diğerleri arasında. Bu gelişmiş RNA-seq yöntemleri, normal ve hastalıklı hücre ve dokudaki transkriptomun kantitatif analizi yoluyla karmaşık RNA fonksiyonlarını ortaya çıkarır.

RNA dizilimindeki bu ilerlemelere rağmen, birkaç temel teknik özellik yöntemin nicel gücünü sınırlamaktadır. Çoğu RNA-seq yöntemi, deneysel değişkenler (yani biyolojik numuneler ve/veya fizyolojik durumlar) arasındaki RNA seviyelerindeki değişikliklerin kesin ve doğru bir şekilde ölçülmesine izin verirken, bir numune içindeki RNA moleküllerinin seviyelerinin nicel karşılaştırmalarını sağlayamazlar. Örneğin, çoğu RNA-seq yöntemi, eksprese edilen tRNA’ların hücresel bir havuzundaki tek tek tRNA izoseptör moleküllerinin nispi kopya sayısını doğru bir şekilde ölçemez. Eşlik eden yayın^7’de vurgulandığı gibi, RNA-seq ile ilgili bu sınırlama, RNA yapısının çeşitli özelliklerinden ve kütüphane hazırlığının biyokimyasından kaynaklanmaktadır. Örneğin, 3′ ve 5′ uçlu dizileme bağlayıcılarını RNA moleküllerine bağlamak için kullanılan ligasyon enzimlerinin aktivitesi, RNA’nın terminal nükleotidlerinin ve dizileme bağlayıcılarının kimliğinden güçlü bir şekilde etkilenir. Bu, bağlayıcı ligasyonlarının verimliliğinde büyük farklılıklara ve sıralama okumalarında derin artefaktal artışlara yol açar ^8,9,10.

İkinci bir sınırlama seti, RNA moleküllerinin doğal yapısal özelliklerinden kaynaklanmaktadır. Spesifik olarak, RNA ikincil yapı oluşumu ve epitranskriptomun düzinelerce transkripsiyon sonrası RNA modifikasyonundaki dinamik değişiklikler, ters transkripsiyon sırasında polimeraz düşmesine veya mutasyonuna neden olabilir. Bu hatalar, eksik veya kesilmiş cDNA sentezi veya değişmiş RNA dizisi ile sonuçlanır. Bu fenomenlerin her ikisi de ikincil yapıları veya bazı modifikasyonları haritalamak için kullanılabilse de, sonraki kütüphane hazırlama adımları kesilmiş cDNA’ları yakalayamazsa veya veri işleme, bir referans veri kümesiyle eşleşmeyen mutasyona uğramış dizileri atarsa, RNA-seq’in nicel doğruluğunu düşürür^11,12. Ayrıca, RNA transkriptlerinin muazzam kimyasal, uzunluk ve yapısal çeşitliliğinin yanı sıra uzun RNA’ları düzgün bir şekilde parçalamak için araçların olmaması, çoğu RNA-seq yönteminin tüm RNA türlerine^{uygulanabilirliğini azaltır 13}.

AQRNA-seq (mutlak miktar tayini RNA dizileme) yöntemi, kantitatif doğruluğu sınırlayan bu teknik ve biyolojik kısıtlamaların birçoğunu ortadan kaldırmak için geliştirilmiştir⁷. RNA dizileme kütüphanesi hazırlığı sırasında yakalama, ligasyon ve amplifikasyonda diziye bağlı önyargıları en aza indiren AQRNA-seq, diğer yöntemlere kıyasla üstün doğrusallık elde eder ve 963 miRNA’dan oluşan bir referans kütüphanesinin %75’ini 2 kat doğrulukla doğru bir şekilde ölçer. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğunun bu doğrusal korelasyonu, RNA oligonükleotid standartlarının değişken uzunluklu bir havuzunun analizinde ve kuzey blotlama gibi ortogonal yöntemlere atıfta bulunulduğunda da gözlenir. Dizileme okuma sayısı ve RNA bolluğu arasında doğrusallık oluşturmak, AQRNA-seq’in bir numune içindeki tüm RNA türlerinin doğru ve mutlak miktar tayinini elde etmesini sağlar.

Burada, AQRNA-seq kitaplığı hazırlama iş akışı ve beraberindeki aşağı akış veri analizi işlem hattı için protokolün bir açıklaması yer almaktadır. Yöntem, Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) tüberküloz modelinde açlığa bağlı uyku hali ve ardından resüsitasyon sırasında tRNA bolluğunun dinamiklerini aydınlatmak için uygulandı. Dizileme verilerinin keşifsel görselleştirilmesi için sonuçlar, çeşitli fenotiplerle ilişkili tRNA bolluğundaki fark edilebilir kalıpları ortaya çıkaran müteakip kümeleme ve diferansiyel ifade analizleriyle birlikte sunuldu.