AQRNA-seq zur Quantifizierung kleiner RNAs

Next-Generation-Sequencing (NGS), auch bekannt als massiv parallele Sequenzierung, ist eine DNA-Sequenzierungstechnologie, die DNA-Fragmentierung, Ligation von Adapter-Oligonukleotiden, Polymerase-Kettenreaktion (PCR)-basierte Amplifikation, Sequenzierung der DNA und Reassemblierung der Fragmentsequenzen zu einem Genom umfasst. Die Anpassung von NGS an Sequenz-RNA (RNA-seq) ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Identifizierung und Quantifizierung von RNA-Transkripten und deren Varianten¹. Innovative Entwicklungen bei Arbeitsabläufen zur Vorbereitung von RNA-Bibliotheken und bioinformatischen Analysepipelines, gepaart mit Fortschritten bei Laborinstrumenten, haben das Repertoire an RNA-Seq-Anwendungen erweitert und sind über die Exomsequenzierung hinaus zu fortschrittlichen funktionellen Omics-Anwendungen wie nicht-kodierendem RNA-Profiling², Einzelzellanalyse³, räumlicher Transkriptomik ^4,5 und alternativer Spleißanalyse⁶ vorangeschrittenunter anderem. Diese fortschrittlichen RNA-seq-Methoden decken komplexe RNA-Funktionen durch quantitative Analyse des Transkriptoms in normalen und erkrankten Zellen und Geweben auf.

Trotz dieser Fortschritte in der RNA-seq schränken mehrere wichtige technische Merkmale die quantitative Leistungsfähigkeit der Methode ein. Während die meisten RNA-seq-Methoden eine präzise und genaue Quantifizierung von Änderungen der RNA-Spiegel zwischen experimentellen Variablen (d. h. biologischen Proben und/oder physiologischen Zuständen) ermöglichen, können sie keine quantitativen Vergleiche der Konzentrationen von RNA-Molekülen in einer Probe liefern. Zum Beispiel können die meisten RNA-seq-Methoden die relative Anzahl der Kopien einzelner tRNA-Isoakzeptormoleküle in einem zellulären Pool exprimierter tRNAs nicht genau quantifizieren. Wie in der Begleitpublikation⁷ hervorgehoben, ergibt sich diese Einschränkung des RNA-seq aus mehreren Merkmalen der RNA-Struktur und der Biochemie der Bibliotheksvorbereitung. Zum Beispiel wird die Aktivität der Ligationsenzyme, die zum Anhängen der 3′- und 5′-End-Sequenzierungslinker an RNA-Moleküle verwendet werden, stark von der Identität der terminalen Nukleotide der RNA und der Sequenzierungslinker beeinflusst. Dies führt zu großen Schwankungen in der Effizienz von Linker-Ligationen und zu tiefgreifenden künstlichen Steigerungen der Sequenzierungs-Reads ^8,9,10.

Eine zweite Reihe von Einschränkungen ergibt sich aus den inhärenten strukturellen Eigenschaften von RNA-Molekülen. Insbesondere die Bildung der RNA-Sekundärstruktur und dynamische Veränderungen in den Dutzenden von posttranskriptionellen RNA-Modifikationen des Epitranskriptoms können zu einem Polymeraseabfall oder einer Mutation während der reversen Transkription führen. Diese Fehler führen zu einer unvollständigen oder verkürzten cDNA-Synthese oder einer veränderten RNA-Sequenz. Während diese beiden Phänomene ausgenutzt werden können, um Sekundärstrukturen oder einige Modifikationen zu kartieren, verschlechtern sie die quantitative Genauigkeit von RNA-seq, wenn nachfolgende Bibliotheksvorbereitungsschritte keine verkürzten cDNAs erfassen oder wenn die Datenverarbeitung mutierte Sequenzen auswirft, die nicht mit einem Referenzdatensatz übereinstimmen^11,12. Darüber hinaus verringert die immense chemische, längen- und strukturelle Vielfalt von RNA-Transkripten sowie der Mangel an Werkzeugen zur gleichmäßigen Fragmentierung langer RNAs die Anwendbarkeit der meisten RNA-seq-Methoden auf alle RNA-Spezies¹³.

Die AQRNA-seq-Methode (absolute Quantifizierung RNA-Sequenzierung) wurde entwickelt, um mehrere dieser technischen und biologischen Einschränkungen zu beseitigen, die die quantitative Genauigkeit einschränken⁷. Durch die Minimierung sequenzabhängiger Verzerrungen bei der Erfassung, Ligation und Amplifikation während der Vorbereitung der RNA-Sequenzierungsbibliotheken erreicht AQRNA-seq eine überlegene Linearität im Vergleich zu anderen Methoden und quantifiziert 75 % einer Referenzbibliothek von 963 miRNAs mit 2-facher Genauigkeit. Diese lineare Korrelation von Sequenzierung, Lesezahl und RNA-Abundanz wird auch bei der Analyse eines Pools variabler Länge von RNA-Oligonukleotidstandards und in Bezug auf orthogonale Methoden wie Northern Blot beobachtet. Die Etablierung der Linearität zwischen der Anzahl der Sequenzierungs-Reads und der RNA-Abundanz ermöglicht AQRNA-seq eine genaue, absolute Quantifizierung aller RNA-Spezies innerhalb einer Probe.

Im Folgenden finden Sie eine Beschreibung des Protokolls für den Workflow zur Vorbereitung von AQRNA-seq-Bibliotheken und der zugehörigen nachgelagerten Datenanalyse-Pipeline. Die Methode wurde angewendet, um die Dynamik der tRNA-Abundanz während der hungerinduzierten Ruhephase und der anschließenden Wiederbelebung im Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG) Modell der Tuberkulose aufzuklären. Die Ergebnisse wurden für die explorative Visualisierung der Sequenzierungsdaten vorgestellt, zusammen mit anschließenden Clustering- und differentiellen Expressionsanalysen, die erkennbare Muster in der tRNA-Abundanz aufdeckten, die mit verschiedenen Phänotypen assoziiert sind.