AQRNA-seq voor het kwantificeren van kleine RNA's

Next-generation sequencing (NGS), ook bekend als massively parallel sequencing, is een DNA-sequencingtechnologie die DNA-fragmentatie, ligatie van adaptor-oligonucleotiden, op polymerasekettingreactie (PCR) gebaseerde amplificatie, sequentiebepaling van het DNA en herassemblage van de fragmentsequenties tot een genoom omvat. De aanpassing van NGS aan sequentie-RNA (RNA-seq) is een krachtige benadering om RNA-transcripten en hun varianten te identificeren en te kwantificeren¹. Innovatieve ontwikkelingen in workflows voor de voorbereiding van RNA-bibliotheken en pijplijnen voor bio-informaticaanalyse, in combinatie met vooruitgang in laboratoriuminstrumentatie, hebben het repertoire van RNA-seq-toepassingen uitgebreid, en zijn verder gegaan dan exoomsequencing naar geavanceerde functionele omics zoals niet-coderende RNA-profilering², analyse van één cel³, ruimtelijke transcriptomics ^4,5, alternatieve splicinganalyse⁶onder andere. Deze geavanceerde RNA-seq-methoden onthullen complexe RNA-functies door middel van kwantitatieve analyse van het transcriptoom in normale en zieke cellen en weefsels.

Ondanks deze vooruitgang in RNA-seq, beperken verschillende belangrijke technische kenmerken de kwantitatieve kracht van de methode. Hoewel de meeste RNA-seq-methoden nauwkeurige en nauwkeurige kwantificering van veranderingen in de niveaus van RNA’s tussen experimentele variabelen (d.w.z. biologische monsters en/of fysiologische toestanden) mogelijk maken, kunnen ze geen kwantitatieve vergelijkingen maken van de niveaus van RNA-moleculen in een monster. De meeste RNA-seq-methoden kunnen bijvoorbeeld het relatieve aantal kopieën van individuele tRNA-isoacceptormoleculen in een cellulaire pool van tot expressie gebrachte tRNA’s niet nauwkeurig kwantificeren. Zoals benadrukt in de begeleidende publicatie⁷, komt deze beperking tot RNA-seq voort uit verschillende kenmerken van de RNA-structuur en de biochemie van bibliotheekvoorbereiding. De activiteit van de ligatie-enzymen die worden gebruikt om de 3′- en 5′-end sequencing linkers aan RNA-moleculen te hechten, wordt bijvoorbeeld sterk beïnvloed door de identiteit van de terminale nucleotiden van het RNA en de sequencing linkers. Dit leidt tot grote variaties in de efficiëntie van linkerligaties en diepgaande artefactische verhogingen in sequencing reads ^8,9,10.

Een tweede reeks beperkingen vloeit voort uit de inherente structurele eigenschappen van RNA-moleculen. In het bijzonder kunnen de vorming van secundaire RNA-structuren en dynamische veranderingen in de tientallen post-transcriptionele RNA-modificaties van het epitranscriptoom polymerase-uitval of mutatie veroorzaken tijdens omgekeerde transcriptie. Deze fouten resulteren in onvolledige of afgekapte cDNA-synthese of veranderde RNA-sequentie. Hoewel beide fenomenen kunnen worden uitgebuit om secundaire structuren of sommige wijzigingen in kaart te brengen, verslechteren ze de kwantitatieve nauwkeurigheid van RNA-seq als de volgende stappen voor de voorbereiding van de bibliotheek er niet in slagen afgekapte cDNA’s vast te leggen of als gegevensverwerking gemuteerde sequenties weggooit die niet overeenkomen met een referentiedataset^11,12. Bovendien vermindert de immense chemische, lengte- en structurele diversiteit van RNA-transcripten, evenals het gebrek aan hulpmiddelen om lange RNA’s uniform te fragmenteren, de toepasbaarheid van de meeste RNA-seq-methoden op alle RNA-soorten¹³.

De AQRNA-seq-methode (absolute kwantificering RNA-sequencing) is ontwikkeld om een aantal van deze technische en biologische beperkingen weg te nemen die de kwantitatieve nauwkeurigheid beperken⁷. Door sequentieafhankelijke vooroordelen bij het vastleggen, ligeren en amplificeren tijdens de voorbereiding van de RNA-sequencingbibliotheek te minimaliseren, bereikt AQRNA-seq superieure lineariteit in vergelijking met andere methoden, waarbij 75% van een referentiebibliotheek van 963 miRNA’s nauwkeurig wordt gekwantificeerd met een 2-voudige nauwkeurigheid. Deze lineaire correlatie van sequencing, leestelling en RNA-overvloed wordt ook waargenomen in een analyse van een pool van RNA-oligonucleotidestandaarden met variabele lengte en in verwijzing naar orthogonale methoden zoals northern blotting. Door lineariteit vast te stellen tussen sequencing, het aantal leessnelheden en de overvloed aan RNA kan AQRNA-seq een nauwkeurige, absolute kwantificering van alle RNA-soorten in een monster bereiken.

Hier volgt een beschrijving van het protocol voor de workflow voor de voorbereiding van de AQRNA-seq-bibliotheek en de bijbehorende downstream data-analysepijplijn. De methode werd toegepast om de dynamiek van de tRNA-overvloed tijdens door uithongering veroorzaakte rustperiode en daaropvolgende reanimatie op te helderen in het Mycobacterium bovis bacillen de Calmette et Guérin (BCG) model van tuberculose. De resultaten werden gepresenteerd voor de verkennende visualisatie van de sequentiegegevens, samen met daaropvolgende clustering- en differentiële expressieanalyses die waarneembare patronen in de overvloed aan tRNA onthulden die verband houden met verschillende fenotypes.