AQRNA-seq для количественного определения малых РНК
Summary
Абсолютное количественное секвенирование РНК (AQRNA-seq) — это технология, разработанная для количественной оценки ландшафта всех малых РНК в биологических смесях. В данной работе продемонстрированы этапы подготовки библиотеки и обработки данных AQRNA-seq, количественно оценивающие изменения в пуле транспортной РНК (тРНК) в Mycobacterium bovis BCG во время периода покоя, вызванного голоданием.
Abstract
AQRNA-seq обеспечивает прямую линейную зависимость между количеством прочтений секвенирования и числом малых копий РНК в биологическом образце, что позволяет точно количественно оценить пул малых РНК. Описанная здесь процедура подготовки библиотеки AQRNA-seq включает в себя использование специально разработанных линкеров секвенирования и этап снижения модификаций метилирования РНК, которые блокируют процесс обратной транскрипции, что приводит к увеличению выхода полноразмерных кДНК. Кроме того, подробно описана реализация сопутствующего биоинформатического конвейера. Эта демонстрация AQRNA-seq была проведена путем количественного анализа 45 тРНК в Mycobacterium bovis BCG, собранных в течение 5 выбранных дней в течение 20-дневного курса депривации питательных веществ и 6 дней реанимации. Здесь также будут обсуждаться текущие усилия по повышению эффективности и строгости AQRNA-seq. Это включает в себя изучение методов предотвращения очистки геля для смягчения проблем с димерами праймера после амплификации ПЦР и увеличения доли полноразмерных прочтений для обеспечения более точного картирования считываний. Будущие усовершенствования AQRNA-seq будут сосредоточены на содействии автоматизации и высокопроизводительному внедрению этой технологии для количественного определения всех малых видов РНК в образцах клеток и тканей различных организмов.
Introduction
Секвенирование нового поколения (NGS), также известное как массово-параллельное секвенирование, представляет собой технологию секвенирования ДНК, которая включает в себя фрагментацию ДНК, лигирование адапторных олигонуклеотидов, амплификацию на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР), секвенирование ДНК и повторную сборку последовательностей фрагментов в геном. Адаптация NGS к секвенированной РНК (РНК-секвенирование) является мощным подходом к идентификации и количественному определению РНК-транскриптов и их вариантов1. Инновационные разработки в области подготовки библиотек РНК и биоинформатического анализа в сочетании с достижениями в области лабораторного оборудования расширили репертуар приложений РНК-секвенирования, перейдя от секвенирования экзома к передовым функциональным омикам, таким как профилирование некодирующих РНК2, анализ одиночных клеток3, пространственная транскриптомика 4,5, анализ альтернативного сплайсинга6, в том числе. Эти передовые методы РНК-секвенирования выявляют сложные функции РНК посредством количественного анализа транскриптома в нормальных и больных клетках и тканях.
Несмотря на эти достижения в области РНК-секвенирования, несколько ключевых технических особенностей ограничивают количественную мощность метода. В то время как большинство методов секвенирования РНК позволяют точно и точно количественно оценить изменения уровней РНК между экспериментальными переменными (т.е. биологическими образцами и/или физиологическими состояниями), они не могут обеспечить количественное сравнение уровней молекул РНК в образце. Например, большинство методов РНК-секвенирования не могут точно количественно определить относительное число копий отдельных молекул изоакцептора тРНК в клеточном пуле экспрессированных тРНК. Как подчеркивается в сопутствующей публикации7, это ограничение в отношении РНК-секвенирования обусловлено рядом особенностей структуры РНК и биохимии библиотечного приготовления. Например, активность ферментов лигирования, используемых для присоединения линкеров 3′- и 5′-концевого секвенирования к молекулам РНК, сильно зависит от идентичности концевых нуклеотидов РНК и линкеров секвенирования. Это приводит к значительным вариациям эффективности линкерных лигирования и значительному артефактному увеличению прочтений секвенирования 8,9,10.
Второй набор ограничений вытекает из присущих молекулам РНК структурных свойств. В частности, формирование вторичной структуры РНК и динамические изменения в десятках посттранскрипционных модификаций РНК эпитранскриптома могут вызывать спад полимеразы или мутацию во время обратной транскрипции. Эти ошибки приводят к неполному или усеченному синтезу кДНК или изменению последовательности РНК. Хотя оба эти явления могут быть использованы для картирования вторичных структур или некоторых модификаций, они снижают количественную точность RNA-seq, если на последующих этапах подготовки библиотеки не удается захватить усеченные кДНК или если обработка данных отбрасывает мутировавшие последовательности, не соответствующие эталонному набору данных. Кроме того, огромное химическое, длинное и структурное разнообразие РНК-транскриптов, а также отсутствие инструментов для равномерной фрагментации длинных РНК уменьшают применимость большинства методов РНК-секвенирования ко всем видам РНК13.
Метод AQRNA-seq (секвенирование РНК в абсолютном количестве) был разработан для устранения некоторых из этих технических и биологических ограничений, ограничивающих количественную точность. Сводя к минимуму зависящие от последовательности смещения при захвате, лигировании и амплификации во время подготовки библиотеки секвенирования РНК, AQRNA-seq достигает превосходной линейности по сравнению с другими методами, точно количественно определяя 75% референсной библиотеки из 963 микроРНК с 2-кратной точностью. Эта линейная корреляция между количеством прочтений секвенирования и распространенностью РНК также наблюдается при анализе пула стандартов олигонуклеотидов РНК переменной длины и в отношении ортогональных методов, таких как нортерн-блоттинг. Установление линейности между количеством прочтений секвенирования и обилием РНК позволяет AQRNA-seq достичь точной, абсолютной количественной оценки всех видов РНК в образце.
Ниже приведено описание протокола для рабочего процесса подготовки библиотеки AQRNA-seq и сопутствующего нисходящего конвейера анализа данных. Метод был применен для выяснения динамики численности тРНК во время состояния покоя, вызванного голоданием, и последующей реанимации в модели туберкулеза Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). Были представлены результаты исследовательской визуализации данных секвенирования, а также последующего кластерного и дифференциального анализа экспрессии, которые выявили различимые закономерности в распространенности тРНК, связанные с различными фенотипами.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рабочий процесс подготовки библиотеки AQRNA-seq предназначен для максимального захвата РНК в образце и минимизации падения полимеразы во время обратной транскрипции7. С помощью двухэтапного линкерного лигирования новые олигонотиды ДНК (Линкер 1 и Линкер 2) лигируются в избытк…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы настоящей работы выражают признательность авторам оригинальной статьи, описывающей технологию AQRNA-seq7. Эта работа была поддержана грантами Национальных институтов здравоохранения (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) и Национального исследовательского фонда Сингапура через Альянс Сингапура-Массачусетского технологического института по исследованиям и технологиям устойчивости к противомикробным препаратам IRG.
Materials
| 2-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | 75890 | Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2938C | |
| 5'-deadenylase (50 U/μL) | New England Biolabs | M0331S (component #: M0331SVIAL) | Store at -20 °C |
| Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) | New England Biolabs | M0437M (component #: N0437AVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| AGAROSE GPG/LE | AmericanBio | AB00972-00500 | Store at ambient temperature |
| Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate | Sigma-Aldrich | F2262 | Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C |
| Bioanalyzer Small RNA Analysis | Agilent | 5067-1548 | The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation) |
| Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) | New England Biolabs | B9000 | This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200). |
| Chloroform | Macron Fine Chemicals | 4441-10 | |
| Demethylase | ArrayStar | AS-FS-004 | Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004) |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447L (component #: N0447LVIAL) | This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each) |
| Digital Dual Heat Block | VWR Scientific Products | 13259-052 | Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| DyeEx 2.0 Spin Kit | Qiagen | 63204 | Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length) |
| Electrophoresis Power Supply | Bio-Rad Labrotories | PowerPac 300 | |
| Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 0030124537 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL) | Eppendorf | 022363611 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 022363204 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL) | Eppendorf | 022363352 | |
| Ethyl alcohol (Ethanol), Pure | Sigma-Aldrich | E7023 | The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research |
| Gel Imaging System | Alpha Innotech | FluorChem 8900 | |
| Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS | New England Biolabs | N0556S (component #: B7025SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 840-309000 | The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C |
| Hydrochloric acid (HCl) | VWR Scientific Products | BDH3028 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure | Macron Fine Chemicals | 3032-16 | Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415D | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| NEBuffer 2 (10X) | New England Biolabs | M0264L (component #: B7002SVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated) | Thermo Fisher Scientific | AM9938 | |
| Oligo Clean & Concentrator Kit | Zymo Research | D4061 | Store at ambient temperature |
| PEG 8000 (50% solution) | New England Biolabs | M0437M (component #: B1004SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC |
| Peltier Thermal Cycler | MJ Research | PTC-200 | |
| Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 | Thermo Fisher Scientific | J62336 | |
| PrimeScript Buffer (5X) | TaKaRa | 2680A | |
| PrimeScript Reverse Transcriptase | TaKaRa | 2680A | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | This kit requires a heating block and isopropanol to work with |
| Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0551S (component #: N0551SVIAL) | |
| Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder | New England Biolabs | N0556S (component #: N0556SVIAL) | NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS |
| RecJf (30 U/μL) | New England Biolabs | M0264L (component #: M0264LVIAL) | NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C |
| RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) | New England Biolabs | M0314L (component #: M0314LVIAL) | Store at -20 °C |
| SeqAMP DNA Polymerase | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| SeqAMP PCR Buffer (2X) | TaKaRa | 638509 | TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X) |
| Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) | New England Biolabs | M0371L (component #: M0371LVIAL) | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature |
| T4 DNA Ligase (400 U/μL) | New England Biolabs | M0202L (component #: M0202LVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0202L (component #: B0202SVIAL) | NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) |
| T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) | New England Biolabs | M0437M (component #: M0437MVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
| T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) | New England Biolabs | M0437M (component #: B0216SVIAL) | NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM) |
References
- Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
- Grillone, K., et al. Non-coding RNAs in cancer: platforms and strategies for investigating the genomic "dark matter.". J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 117 (2020).
- Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines. Exp Mol Med. 50 (8), 1-14 (2018).
- Goh, J. J. L., et al. Highly specific multiplexed RNA imaging in tissues with split-FISH. Nat Methods. 17 (7), 689-693 (2020).
- Moses, L., Pachter, L. Museum of spatial transcriptomics. Nat Methods. 19 (5), 534-546 (2022).
- Cummings, B. B., et al. Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Sci Transl Med. 9 (386), 5209 (2017).
- Hu, J. F., et al. Quantitative mapping of the cellular small RNA landscape with AQRNA-seq. Nat Biotech. 39 (8), 978-988 (2021).
- Alon, S., et al. Barcoding bias in high-throughput multiplex sequencing of miRNA. Genome Res. 21 (9), 1506-1511 (2011).
- Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10 (5), e0126049 (2015).
- Pang, Y. L. J., Abo, R., Levine, S. S., Dedon, P. C. Diverse cell stresses induce unique patterns of tRNA up- and down-regulation: tRNA-seq for quantifying changes in tRNA copy number. Nuc Acids Res. 42 (22), e170 (2014).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Li, F., et al. Regulatory impact of RNA secondary structure across the Arabidopsis transcriptome. Plant Cell. 24 (11), 4346-4359 (2012).
- García-Nieto, P. E., Wang, B., Fraser, H. B. Transcriptome diversity is a systematic source of variation in RNA-sequencing data. PLOS Comput Biol. 18 (3), e1009939 (2022).
- . FASTQC: a quality control tool for high throughput sequence data Available from: https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010)
- Chen, S., Zhou, Y., Chen, Y., Gu, J. Fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor. Bioinformatics. 34 (17), i884-i890 (2018).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. , (2022).
- Ougland, R., et al. AlkB restores the biological function of mRNA and tRNA inactivated by chemical methylation. Mol Cell. 16 (1), 107-116 (2004).
- Bernhardt, H. S., Tate, W. P. Primordial soup or vinaigrette: did the RNA world evolve at acidic pH. Biol Direct. 7, 4 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. J. 17 (1), 10-12 (2011).
