AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Il sequenziamento di nuova generazione (NGS), noto anche come sequenziamento massivamente parallelo, è una tecnologia di sequenziamento del DNA che prevede la frammentazione del DNA, la legatura degli oligonucleotidi adattatori, l’amplificazione basata sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), il sequenziamento del DNA e il riassemblaggio delle sequenze di frammenti in un genoma. L’adattamento dell’NGS all’RNA di sequenza (RNA-seq) è un approccio potente per identificare e quantificare i trascritti di RNA e le loro varianti¹. Gli sviluppi innovativi nei flussi di lavoro per la preparazione delle librerie di RNA e nelle pipeline di analisi bioinformatica, insieme ai progressi nella strumentazione di laboratorio, hanno ampliato il repertorio delle applicazioni RNA-seq, progredendo oltre il sequenziamento dell’esoma verso omiche funzionali avanzate come la profilazione dell’RNA non codificante², l’analisi di singole cellule³, la trascrittomica spaziale ^4,5, l’analisi di splicing alternativo⁶, tra gli altri. Questi metodi avanzati di RNA-seq rivelano funzioni complesse dell’RNA attraverso l’analisi quantitativa del trascrittoma in cellule e tessuti normali e malati.

Nonostante questi progressi nell’RNA-seq, diverse caratteristiche tecniche chiave limitano la potenza quantitativa del metodo. Sebbene la maggior parte dei metodi RNA-seq consenta una quantificazione precisa e accurata dei cambiamenti nei livelli di RNA tra variabili sperimentali (ad esempio, campioni biologici e/o stati fisiologici), non possono fornire confronti quantitativi dei livelli di molecole di RNA all’interno di un campione. Ad esempio, la maggior parte dei metodi RNA-seq non è in grado di quantificare con precisione il numero relativo di copie di singole molecole isoaccettori di tRNA in un pool cellulare di tRNA espressi. Come evidenziato nella pubblicazione complementare⁷, questa limitazione all’RNA-seq deriva da diverse caratteristiche della struttura dell’RNA e dalla biochimica della preparazione della libreria. Ad esempio, l’attività degli enzimi di ligazione utilizzati per legare i linker di sequenziamento delle estremità 3′ e 5′ alle molecole di RNA è fortemente influenzata dall’identità dei nucleotidi terminali dell’RNA e dei linker di sequenziamento. Ciò porta a grandi variazioni nell’efficienza delle legature dei linker e a profondi aumenti artefatti nelle letture del sequenziamento ^8,9,10.

Una seconda serie di limitazioni deriva dalle proprietà strutturali intrinseche delle molecole di RNA. In particolare, la formazione della struttura secondaria dell’RNA e i cambiamenti dinamici nelle dozzine di modifiche post-trascrizionali dell’RNA dell’epitrascrittoma possono causare la caduta o la mutazione della polimerasi durante la trascrizione inversa. Questi errori provocano una sintesi incompleta o troncata del cDNA o un’alterazione della sequenza dell’RNA. Sebbene entrambi questi fenomeni possano essere sfruttati per mappare strutture secondarie o alcune modifiche, degradano l’accuratezza quantitativa dell’RNA-seq se le successive fasi di preparazione della libreria non riescono a catturare cDNA troncati o se l’elaborazione dei dati elimina sequenze mutate che non corrispondono a un set di dati di riferimento^11,12. Inoltre, l’immensa diversità chimica, di lunghezza e strutturale dei trascritti di RNA, così come la mancanza di strumenti per frammentare uniformemente gli RNA lunghi, diminuisce l’applicabilità della maggior parte dei metodi RNA-seq a tutte le specie di RNA¹³.

Il metodo AQRNA-seq (absolute quantification RNA sequencing) è stato sviluppato per rimuovere molti di questi vincoli tecnici e biologici che limitano l’accuratezza quantitativa⁷. Riducendo al minimo le distorsioni sequenza-dipendenti nella cattura, nella legatura e nell’amplificazione durante la preparazione della libreria di sequenziamento dell’RNA, AQRNA-seq raggiunge una linearità superiore rispetto ad altri metodi, quantificando con precisione il 75% di una libreria di riferimento di 963 miRNA con un’accuratezza di 2 volte. Questa correlazione lineare tra sequenziamento, conteggio delle letture e abbondanza di RNA è osservata anche in un’analisi di un pool di standard di oligonucleotidi di RNA a lunghezza variabile e in riferimento a metodi ortogonali come il northern blotting. Stabilire la linearità tra il conteggio delle letture di sequenziamento e l’abbondanza di RNA consente ad AQRNA-seq di ottenere una quantificazione accurata e assoluta di tutte le specie di RNA all’interno di un campione.

Di seguito è riportata una descrizione del protocollo per il flusso di lavoro di preparazione della libreria AQRNA-seq e della pipeline di analisi dei dati a valle associata. Il metodo è stato applicato per chiarire le dinamiche dell’abbondanza di tRNA durante la dormienza indotta dalla fame e la successiva rianimazione nel modello di tubercolosi Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin (BCG). I risultati sono stati presentati per la visualizzazione esplorativa dei dati di sequenziamento, insieme alle successive analisi di clustering e di espressione differenziale che hanno svelato modelli distinguibili nell’abbondanza di tRNA associati a vari fenotipi.