Utilizzo del test Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT&Tag) nella ricerca sui mioblasti di topo

Il saggio CUT&Tag è stato inventato per compensare alcuni difetti evidenti dei ChIP¹. I due principali svantaggi dei ChIP sono 1) la distorsione introdotta durante la frammentazione della cromatina e 2) l’incompetenza nel lavorare con un basso numero di cellule. I saggi X-ChIP si basano sulla sonicazione o sulla digestione MNasi per ottenere frammenti di cromatina, mentre N-ChIP utilizza principalmente la digestione MNasi per ottenere nucleosomi. La sonicazione mostra una tendenza verso le posizioni rilassate della cromatina come le regioni^{promotrici 2} e, a quanto pare, la digestione della MNasi funziona anche in modo più efficiente sulle fibre di cromatina rilassate. Inoltre, alcuni hanno riportato che la digestione della MNasi mostra anche un bias DNA-dipendente³. Pertanto, nella fase di preparazione dell’input dei saggi ChIP, è impossibile ottenere frammenti di cromatina da tutti i tipi di posizioni genomiche in modo perfettamente casuale. Inoltre, i saggi ChIP normalmente generano segnali di fondo più elevati rispetto a CUT&Tag e richiedono oltre 10 volte più letture rispetto a CUT&Tag per accentuare i picchi di ^1,4,5. Questo spiega perché gli esperimenti ChIP devono iniziare con un numero enormemente maggiore di cellule rispetto a CUT&Tag. Questo non è un problema quando si studiano le linee cellulari in quanto possono essere fatte passare ripetutamente per ottenere un numero di cellule molto elevato. Tuttavia, il test ChIP non è sicuramente uno strumento epigenetico potente per studiare popolazioni di cellule primarie rare o preziose, sebbene le cellule primarie abbiano ovviamente implicazioni più pratiche e mediche.

Mentre la lunga e complicata procedura ChIP scoraggia alcuni ricercatori dall’imparare o utilizzare questa tecnica, le persone si sentono più a loro agio con test più semplici come l’immunocitochimica (ICC) o l’immunofluorescenza (IF). Un test CUT&Tag assomiglia essenzialmente al processo degli esperimenti ICC e IF, ma si svolge solo in una provetta. CUT&Tag non ha bisogno di cromatina frammentata per iniziare e, invece, il genoma deve essere intatto per il legame con gli anticorpi¹. Il primo giorno di un esperimento ChIP, i ricercatori normalmente impiegano fino a 4 ore per preparare le cromatine frammentate dai nuclei con sonicazione o digestione MNasi prima che i brevi pezzi di cromatina possano essere mescolati con perle di anticorpi ^4,5. In notevole contrasto, il carico di lavoro del primo giorno di una procedura CUT&Tag consiste semplicemente nell’immobilizzare le cellule in perle di Concanavalina-A e quindi aggiungere l’anticorpo primario sulle perle cellulari. Questo richiede solo ~40 min¹.

Vale la pena ricordare che la scissione sotto i bersagli e il rilascio mediante nucleasi (CUT&RUN) è un’importante alternativa a CUT&Tag. CUT&RUN è stata fondata sulla base di un meccanismo di funzionamento simile a quello di CUT&Tag. In CUT&Tag, gli anticorpi guidano la trasposisi pA/G-Tn5 in tutte le posizioni in cui l’enzima taglierà un pezzo di cromatina e nel frattempo lo taggherà con adattatori per la creazione di librerie, mentre in CUT&RUN, il ruolo di pA/G-Tn5 è svolto dalla pA/G-MNasi che esegue solo la parte di taglio del lavoro⁶. Pertanto, rispetto a CUT&Tag, CUT&RUN richiede un passaggio aggiuntivo che consiste nell’incollare gli adattatori per la creazione di librerie sui pezzi di DNA frammentati pA/G-MNasi ^7,8. A causa delle elevate somiglianze tra CUT&Tag e CUT&RUN, i ricercatori che hanno familiarità con CUT&Tag si adatteranno facilmente a eseguire CUT&RUN in modo competente. Tuttavia, va notato che esistono alcune piccole differenze tra CUT&Tag e CUT&RUN. I protocolli CUT&RUN utilizzano normalmente la concentrazione fisica di sale (~150 mM) nelle fasi di lavaggio, mentre in CUT&Tag, il tampone di lavaggio 300-Dig è ad alto contenuto di sale. Pertanto, CUT&Tag è in grado di controllare il background durante la profilazione di marcature/varianti istoniche o fattori di trascrizione, poiché queste proteine legano direttamente e fortemente il DNA¹. CUT&Tag può incorrere in problemi durante la profilazione dei fattori associati alla cromatina che non legano direttamente il DNA e mostrano una debole affinità con la cromatina. Le fasi di lavaggio ad alto contenuto di sale in CUT&Tag possono eliminare i fattori associati alla cromatina e non causare segnali nell’output finale. Sebbene ci siano casi di successo in cui CUT&Tag può essere utilizzato per profilare^{alcune proteine 9} non istoniche/non trascrizioni, raccomandiamo comunque CUT&RUN rispetto a CUT&Tag per profilare le proteine associate alla cromatina debolmente legate.

Dopo che i mammiferi raggiungono l’età adulta, i loro tessuti muscolari scheletrici contengono ancora cellule staminali muscolari. Durante la lesione muscolare, queste cellule staminali possono essere attivate e subire l’espansione e la differenziazione del numero di cellule per rigenerare le fibre muscolari danneggiate¹⁰. Queste cellule staminali sono note come cellule staminali/satelliti muscolari (MuSC). Dopo che le MuSC sono state isolate dagli animali o una volta attivate da una lesione muscolare, iniziano a proliferare e diventano mioblasti.

Per ottenere MuSC dalla digestione del muscolo scheletrico di topo, i marcatori di superficie MuSC come Vcam1 (Cd106), Cd34 e α7-integrina (Itga7) vengono spesso utilizzati singolarmente o in combinazione per arricchire le MuSC durante la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)¹¹. È stato dimostrato che Cd31^–/Cd45^–/Sca1^–/Vcam1⁺ è probabilmente la migliore combinazione di marcatori per ottenere MuSC¹² puri al >95%. Il FACS è in grado di isolare i MuSC puri subito dopo la digestione dei muscoli freschi. Tuttavia, se il disegno sperimentale non richiede MuSC puri proprio al momento del loro isolamento, la pre-placcatura è più conveniente rispetto alla FACS per ottenere mioblasti puri al >90% (progenie MuSC).

Le muSC appena isolate dai topi non proliferano in modo efficiente nei terreni F10 di Ham integrati con siero fetale bovino (FBS). Per espandere meglio il numero di cellule di MuSC e ottenere un numero sufficiente di mioblasti, è necessario utilizzare il siero di crescita bovina (BGS) al posto dell’FBS. Tuttavia, se il BGS non è disponibile, il terreno completo F10 di Ham (contenente circa il 20% di FBS) può essere miscelato con un volume uguale di terreno condizionale delle cellule T per promuovere notevolmente l’espansione dei mioblasti¹³. Pertanto, questo protocollo descriverà anche la preparazione di terreni MuSC condizionati con cellule T.

Ancora più importante, questo protocollo fornisce un esempio completo dell’esecuzione di saggi H3K4me1 CUT&Tag su mioblasti di topo isolati dai muscoli degli arti posteriori di topo. Si prega di notare che questo protocollo si applica anche ad altri tipi di cellule e ai segni istonici e alle varianti istoniche, e i lettori devono solo ottimizzare il numero di cellule o la quantità di anticorpi per i loro casi in base all’arricchimento dei segni istonici specifici o delle varianti che studiano.

Per essere utilizzato in CUT&Tag o CUT&RUN, il Tn5 o la MNasi devono essere fusi con la proteina A o la proteina G per produrre pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNasi o pG-MNasi. Apparentemente, sia la proteina A che la proteina G possono essere fuse su questi enzimi allo stesso tempo per generare pA/G-Tn5 o pA/G-MNasi. La proteina A e la proteina G mostrano affinità differenziali con le IgG di specie diverse. Pertanto, fondere la proteina A e la proteina G insieme all’enzima può superare questo problema e rendere l’enzima compatibile con gli anticorpi di più specie.