استخدام الانقسام تحت الأهداف ومقايسة العلامات (CUT &Tag) في أبحاث الأرومة العضلية للفأر
Summary
سيجد الباحثون الجدد في مجال الوراثة اللاجينية أن CUT&Tag بديل أسهل بكثير لمقايسات ChIP. استفادت CUT&Tag بشكل كبير من الدراسات اللاجينية على مجموعات الخلايا النادرة والأولية ، مما أدى إلى توليد بيانات عالية الجودة من عدد قليل جدا من الخلايا. يصف هذا البروتوكول إجراء فحوصات H3K4me1 CUT&Tag على الخلايا العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر.
Abstract
تهدف ورقة البروتوكول هذه إلى تزويد الباحثين الجدد بالتفاصيل الكاملة لاستخدام الانقسام تحت الأهداف والوسم (CUT&Tag) لتحديد المواقع الجينومية لعوامل ربط الكروماتين وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون. تعمل بروتوكولات CUT&Tag بشكل جيد للغاية مع الخلايا العضلية للفأر والخلايا الجذعية العضلية المعزولة حديثا (MuSCs). يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من أنواع الخلايا الأخرى طالما يمكن تجميد الخلايا بواسطة حبات Concanavalin-A. بالمقارنة مع CUT &Tag ، فإن فحوصات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) هي تجارب تستغرق وقتا طويلا. تتطلب فحوصات ChIP المعالجة المسبقة للكروماتين قبل استخدام المادة اللونية للترسيب المناعي. في ChIP عبر الربط (X-ChIP) ، تتضمن المعالجة المسبقة للكروماتين الربط المتقاطع والصوتنة لتفتيت الكروماتين. في حالة ChIP الأصلي (N-ChIP) ، يتم تحقيق الكروماتين المجزأ عادة عن طريق هضم نوكلياز المكورات الدقيقة (MNase). يقدم كل من صوتنة وهضم MNase بعض التحيز لتجارب ChIP. يمكن الانتهاء من فحوصات CUT &Tag في خطوات أقل وتتطلب خلايا أقل بكثير مقارنة ب ChIPs ولكنها توفر معلومات أكثر غير متحيزة حول عوامل النسخ أو علامات الهستون في مواقع جينومية مختلفة. يمكن أن يعمل CUT&Tag مع ما لا يقل عن 5000 خلية. نظرا لحساسيتها العالية وإشارة الخلفية الأقل من ChIPs ، يمكن للباحثين توقع الحصول على بيانات ذروة موثوقة من عدة ملايين من القراءات بعد التسلسل.
Introduction
تم اختراع اختبار CUT &Tag للتعويض عن بعض العيوب العلنية في ChIPs1. عيبان رئيسيان ل ChIPs هما 1) التحيز الذي تم تقديمه عند تجزئة الكروماتين و 2) عدم الكفاءة للعمل مع أرقام الخلايا المنخفضة. تعتمد مقايسات X-ChIP إما على صوتنة أو هضم MNase للحصول على شظايا الكروماتين ، بينما يستخدم N-ChIP في الغالب هضم MNase للحصول على النيوكليوسومات. يظهر Sonication تحيزا نحو مواقع الكروماتين المسترخية مثل مناطق المروج2 ، وعلى ما يبدو ، يعمل هضم MNase أيضا بشكل أكثر كفاءة على ألياف الكروماتين المريحة. علاوة على ذلك ، أفاد البعض أن هضم MNase يظهر أيضا تحيزا يعتمد على تسلسل الحمض النووي3. لذلك ، في خطوة إعداد المدخلات لمقايسات ChIP ، من المستحيل الحصول على شظايا الكروماتين من جميع أنواع المواقع الجينومية بطريقة عشوائية تماما. علاوة على ذلك ، عادة ما تولد مقايسات ChIP إشارات خلفية أعلى مقارنة ب CUT &Tag وتتطلب قراءات أكثر من 10 أضعاف من CUT &Tag لإبراز مكان القمم1،4،5. وهذا يفسر لماذا يجب أن تبدأ تجارب ChIP بخلايا أكثر بكثير من CUT&Tag. هذه ليست مشكلة عند دراسة خطوط الخلايا حيث يمكن تمريرها بشكل متكرر لتحقيق عدد خلايا مرتفع جدا. ومع ذلك ، فإن اختبار ChIP ليس بالتأكيد أداة جينية قوية لدراسة مجموعات الخلايا الأولية النادرة أو الثمينة ، على الرغم من أن الخلايا الأولية تحمل بوضوح آثارا عملية وطبية أكثر.
في حين أن إجراء ChIP الطويل والمعقد لا يشجع بعض الباحثين على تعلم أو استخدام هذه التقنية ، فإن الناس أكثر راحة مع المقايسات الأسهل مثل الكيمياء المناعية (ICC) أو التألق المناعي (IF). يشبه اختبار CUT &Tag بشكل أساسي عملية تجارب ICC و IF ولكنه يحدث فقط في أنبوب اختبار. لا يحتاج CUT&Tag إلى كروماتين مجزأ ليبدأ به ، وبدلا من ذلك ، يجب أن يكون الجينوم سليما لربط الأجسام المضادة1. في اليوم الأول من تجربة ChIP ، يقضي الباحثون عادة ما يصل إلى 4 ساعات في تحضير الكروماتين المجزأ من النوى باستخدام صوتنة أو هضم MNase قبل خلط قطع الكروماتين القصيرة مع حبات الأجسام المضادة 4,5. في تناقض ملحوظ ، فإن عبء العمل في اليوم الأول لإجراء CUT &Tag هو مجرد شل حركة الخلايا إلى حبات Concanavalin-A ثم إضافة الجسم المضاد الأساسي إلى حبات الخلية. هذا يتطلب فقط ~ 40 دقيقة1.
ومن الجدير بالذكر أن الانقسام تحت الأهداف والإطلاق باستخدام النيوكلياز (CUT&RUN) هو بديل مهم ل CUT&Tag. تم إنشاء CUT &RUN بناء على آلية عمل مماثلة ل CUT&Tag. في CUT&Tag ، توجه الأجسام المضادة ترانسبوزاز pA / G-Tn5 إلى جميع المواقع التي يقوم فيها كل إنزيم بقطع قطعة من الكروماتين وفي الوقت نفسه وضع علامة عليها باستخدام محولات صنع المكتبة ، بينما في CUT &RUN ، يتم لعب دور pA / G-Tn5 بواسطة pA / G-MNase الذي يؤدي فقط جزء القطع من المهمة6. لذلك ، بالمقارنة مع CUT &Tag ، يتطلب CUT &RUN خطوة إضافية وهي لصق محولات صنع المكتبة على قطع الحمض النووي المجزأة pA / G-MNase 7,8. نظرا لأوجه التشابه العالية بين CUT&Tag و CUT&RUN ، فإن الباحثين المطلعين على CUT&Tag سوف يتكيفون بسهولة مع أداء CUT &RUN بكفاءة. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى وجود بعض الاختلافات الطفيفة بين CUT &Tag و CUT &RUN. تستخدم بروتوكولات CUT &RUN عادة التركيز المادي للملح (~ 150 mM) في خطوات الغسيل ، بينما في CUT &Tag ، يكون مخزن الغسيل المؤقت 300-Dig غنيا بالملح. لذلك ، فإن CUT &Tag جيد في التحكم في الخلفية عند تحديد سمات / متغيرات الهستون أو عوامل النسخ ، حيث ترتبط هذه البروتينات بشكل مباشر وقوي بالحمض النووي1. قد يواجه CUT&Tag مشاكل عند تنميط العوامل المرتبطة بالكروماتين التي لا تربط الحمض النووي مباشرة وتظهر تقاربا ضعيفا مع الكروماتين. قد تؤدي خطوات الغسيل عالية الملح في CUT&Tag إلى تجريد العوامل المرتبطة بالكروماتين ولا تسبب أي إشارات في الإخراج النهائي. على الرغم من وجود حالات ناجحة حيث يمكن استخدام CUT&Tag لتعريف بعض البروتينات غير الهستونية / غير النسخية9 ، ما زلنا نوصي ب CUT &RUN عبر CUT&Tag لتعريف البروتينات المرتبطة بالكروماتين المرتبطة بشكل ضعيف.
بعد بلوغ الثدييات مرحلة البلوغ، لا تزال أنسجة عضلاتها الهيكلية تحتوي على خلايا جذعية عضلية. أثناء إصابة العضلات ، يمكن تنشيط هذه الخلايا الجذعية والخضوع لتوسيع عدد الخلايا والتمايز لتجديد ألياف العضلات التالفة10. تعرف هذه الخلايا الجذعية باسم الخلايا الجذعية / الساتلية العضلية (MuSCs). بعد عزل MuSCs من أو تنشيطها مرة واحدة عن طريق إصابة العضلات ، فإنها تبدأ في التكاثر وتصبح الأرومات العضلية.
للحصول على MuSCs من هضم العضلات الهيكلية للفأر ، غالبا ما تستخدم علامات سطح MuSC مثل Vcam1 (Cd106) و Cd34 و α7-integrin (Itga7) بشكل فردي أو في مجموعات لإثراء MuSCs أثناء فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) 11. لقد ثبت أن Cd31– / Cd45– / Sca1– / Vcam1 + هو على الأرجح أفضل مزيج علامات للحصول على >95٪ MuSCsنقية 12. يمكن ل FACS عزل MuSCs النقية مباشرة بعد هضم العضلات الطازجة. ومع ذلك ، إذا كان التصميم التجريبي لا يتطلب MuSCs نقية عند عزلها مباشرة ، فإن الطلاء المسبق يكون أكثر فعالية من حيث التكلفة من FACS للحصول على >90٪ من الخلايا العضلية النقية (ذرية MuSC).
لا تتكاثر MuSCs المعزولة حديثا من الفئران بكفاءة في وسائط Ham’s F10 المكملة بمصل الأبقار الجنيني (FBS). لتوسيع عدد خلايا MuSCs بشكل أفضل والحصول على عدد كاف من الخلايا العضلية ، يجب استخدام مصل نمو الأبقار (BGS) بدلا من FBS. ومع ذلك ، إذا لم يكن BGS متاحا ، فيمكن خلط وسائط Ham’s F10 الكاملة (التي تحتوي على حوالي 20٪ FBS) مع حجم متساو من الوسائط الشرطية للخلايا التائية لتعزيز توسع الخلايا العضلية13 بشكل كبير. لذلك ، سيصف هذا البروتوكول أيضا تحضير وسائط MuSC المكيفة لوسائط الخلايا التائية.
الأهم من ذلك ، يوفر هذا البروتوكول مثالا كاملا على إجراء فحوصات H3K4me1 CUT &Tag على الأرومات العضلية للفأر المعزولة من عضلات الأطراف الخلفية للفأر. يرجى ملاحظة أن هذا البروتوكول ينطبق أيضا على أنواع الخلايا الأخرى وعلامات الهستون ومتغيرات الهستون ، ويحتاج القراء فقط إلى تحسين أرقام الخلايا أو كميات الأجسام المضادة لحالاتهم بناء على إثراء علامات أو متغيرات هيستون المحددة التي يدرسونها.
من أجل استخدامها في CUT&Tag أو CUT&RUN، يجب دمج Tn5 أو MNase مع البروتين A أو البروتين G لصنع pA-Tn5 أو pG-Tn5 أو pA-MNase أو pG-MNase. على ما يبدو ، يمكن دمج كل من البروتين A والبروتين G على هذه الإنزيمات في نفس الوقت لتوليد pA / G-Tn5 أو pA / G-MNase. يظهر البروتين A والبروتين G تقاربات تفاضلية مع IgGs من أنواع مختلفة. ومن ثم، فإن دمج البروتين A والبروتين G تماما في الإنزيم يمكن أن يتغلب على هذه المشكلة ويجعل الإنزيم متوافقا مع الأجسام المضادة من أنواع متعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد رقم الخلية المحدد المطلوب في تفاعل CUT&Tag معين تماما على إثراء علامات / متغيرات الهستون أو البروتينات المرتبطة بالكروماتين التي سيتم اختبارها. عادة بالنسبة لعلامات الهستون المخصبة جدا مثل H3K4me1 و H3K4me3 و H3K27ac وما إلى ذلك ، فإن 25000-50000 عضلي كافية تماما لتفاعل CUT&Tag واحد. ومع ذلك ، قد تتطلب بعض …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (XDA16020400 إلى PH) ؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170804 إلى PH).
Materials
| bFGF | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004177 | |
| Concanavalin-A | Sigma-Aldrich | C5275 | |
| Concanavalin-A beads | Bangs Laboratories | BP531 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 300410 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30396.03 | |
| H3K4me1 antibody | abcam | ab8895 | |
| Ham's F10 media | Thermo Fisher Scientific | 11550043 | |
| Hyperactive Universal CUT&Tag Assay Kit for Illumina | Vazyme | TD903 | This kit has been tested by us to function well |
| Magnetic rack for 1.5 mL EP tubes | Qualityard | QYM06 | |
| Magnetic rack for 8-PCR tube stripes | Anosun Magnetic | CLJ16/21-021 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix | NEB | M0541L | For library-making PCR reaction |
| pA-Tn5 | Vazyme | S603-01 | Needs to be mounted with adaptors before use |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 5056489001 | |
| Proteinase K | Beyotime | ST535-100mg | |
| RPMI-1640 media | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Secondary antibody (Guinea Pig anti-rabbit IgG) | Antibodies-online | ABIN101961 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S2626 | |
| TruePrep Index Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD202 | This kit provide Illumina N7XX and N5XX primers |
| VAHTS DNA Clean Beads | Vazyme | N411 | Can substitute Ampure XP beads. Can purify CUT&Tag libraries and select DNA fragments by size |
References
- Kaya-Okur, H. S., et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nat Commun. 10 (1), 1930 (2019).
- Skene, P. J., Henikoff, S. A simple method for generating high-resolution maps of genome-wide protein binding. eLife. 4, e09225 (2015).
- Nikitina, T., Wang, D., Gomberg, M., Grigoryev, S. A., Zhurkin, V. B. Combined micrococcal nuclease and exonuclease III digestion reveals precise positions of the nucleosome core/linker junctions: implications for high-resolution nucleosome mapping. J Mol Biol. 425 (11), 1946-1960 (2013).
- Policastro, R. A., Zentner, G. E. Enzymatic methods for genome-wide profiling of protein binding sites. Brief Funct Genomics. 17 (2), 138-145 (2018).
- Teytelman, L., Thurtle, D. M., Rine, J., van Oudenaarden, A. Highly expressed loci are vulnerable to misleading ChIP localization of multiple unrelated proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18602-18607 (2013).
- Skene, P. J., Henikoff, S. An efficient targeted nuclease strategy for high-resolution mapping of DNA binding sites. eLife. 6, e21856 (2017).
- Mezger, A., et al. High-throughput chromatin accessibility profiling at single-cell resolution. Nat Commun. 9, 3647 (2018).
- Zheng, G. X., et al. Massively parallel digital transcriptional profiling of single cells. Nat Commun. 8, 14049 (2017).
- Nakka, K., et al. JMJD3 activated hyaluronan synthesis drives muscle regeneration in an inflammatory environment. Science. 377 (6606), 666-669 (2022).
- Fu, X., Wang, H., Hu, P. Stem cell activation in skeletal muscle regeneration. Cell Mol Life Sci. 72 (9), 1663-1677 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skelet Muscle. 6, 35 (2016).
- Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), 609-621.e6 (2019).
- Fu, X., et al. Combination of inflammation-related cytokines promotes long-term muscle stem cell expansion. Cell Res. 25 (6), 655-673 (2015).
- Li, Y., et al. Chromatin and transcription factor profiling in rare stem cell populations using CUT&Tag. STAR Protoc. 2 (3), 100751 (2021).
- Tapscott, S. J., Davis, R. L., Lassar, A. B., Weintraub, H. MyoD: a regulatory gene of skeletal myogenesis. Advances in Experimental Medicine and Biology. 280, 3-6 (1990).
- Wardle, F. C. Master control: transcriptional regulation of mammalian Myod. J Muscle Res Cell Motil. 40 (2), 211-226 (2019).
- Local, A., et al. Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers. Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Faralli, H., et al. UTX demethylase activity is required for satellite cell-mediated muscle regeneration. J Clin Invest. 126 (4), 1555-1565 (2016).
- Yang, J. H., et al. Myogenic transcriptional activation of MyoD mediated by replication-independent histone deposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (1), 85-90 (2011).
- Kaya-Okur, H. S., Janssens, D. H., Henikoff, J. G., Ahmad, K., Henikoff, S. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nat Protoc. 15 (10), 3264-3283 (2020).
