Summary

ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

単離された末梢血単核細胞は、免疫機能や免疫障害、代謝性疾患、またはミトコンドリア機能の解析に使用できます。この研究では、全血からのPBMCの調製とその後の凍結保存のための標準化された方法について説明します。凍結保存は、この時間と場所を独立させます。

Abstract

真核細胞の生理機能は、主にミトコンドリアが提供するエネルギーに依存しています。ミトコンドリアの機能不全は、代謝性疾患や老化に関連しています。酸化的リン酸化は、エネルギー的な恒常性の維持に不可欠であるため、決定的な役割を果たします。PBMCは、ミトコンドリア機能を測定するための低侵襲サンプルとして同定されており、疾患状態を反映することが示されています。しかし、ミトコンドリアの生体エネルギー機能の測定は、ヒトサンプル中のいくつかの要因によって制限される可能性があります。制限は、採取するサンプルの量、サンプリング時間 (多くの場合、数日間に分散)、および場所です。採取したサンプルを凍結保存することで、サンプルの一貫した収集と測定が可能になります。測定されたパラメータが、凍結保存された細胞と新たに調製された細胞の間で同等であることを確認するように注意する必要があります。ここでは、ヒト血液サンプルからPBMCを単離・凍結保存し、これらの細胞におけるミトコンドリアの生体エネルギー機能を解析する方法について述べる。ここに記載されているプロトコールに従って凍結保存されたPBMCは、新たに採取した細胞と比較して、細胞数と生存率、アデノシン三リン酸レベル、および測定された呼吸鎖活性にわずかな違いしか示しません。記載された調製物に必要なヒト血液はわずか8〜24mLであり、臨床試験中にサンプルを多中心的に収集し、その場で生体エネルギーを決定することを可能にします。

Introduction

ヒト末梢血単核球(PBMC)は、老化プロセスや変性疾患に関連する問題など、免疫学的および生体エネルギー学的問題の研究を含む、多くの科学分野でさまざまな用途に使用されています1,2。PBMCは組成が不均一で、リンパ球(B細胞、T細胞、NK細胞)、単球、樹状細胞で構成されています。細胞は被験者内で大きな個体差やばらつきを示すことがあるため、これらの細胞を処理するための標準化された手順が必要です。単離の生存率や純度などの重要なパラメータは、その取り扱いの基本的な要件であり、収集時間、メラトニンレベル、被験者が絶食しているかどうかなどの環境要因によってさらに影響を受けます3,4

ここでは、PBMCの生体エネルギーに関する研究に基づいて、他の方法にも適したPBMCの単離、凍結保存、培養方法について説明します。筋生検はミトコンドリアのエネルギー代謝のゴールドスタンダードと考えられていますが5、血球の検査は迅速で低侵襲な手順です。これに加えて、老化やアルツハイマー病(AD)におけるミトコンドリア機能の変化は、脳だけでなく末梢にも起こることを示唆する研究がますます増えています6,7,8,9,10。この方法では、糖尿病や肥満など、他の状態や病気の調査も可能です11,12,13多発性硬化症患者における遺伝子発現パターン、または免疫機能およびそれに対する一般的な影響を分析することができます14,15,16。

PBMCは一般に、酸化的リン酸化(OXPHOS)に依存してアデノシン三リン酸(ATP)を生成します17,18。したがって、PBMCはサロゲートとして幅広い用途をカバーしています。これまでの報告では、PBMCのエネルギー代謝は、早期心不全19、敗血症性ショック20、ミトコンドリア機能の性差4などの臓器機能障害に対処するために用いられてきた。PBMCの凍結保存、単離、培養の一般的な方法は、異なる施設で得られた結果の比較可能性において利点があります。各ステップ21,22のプロトコルには大きなばらつきがあり、この方法の目標は、PBMCにおける生体エネルギー測定のガイドラインを提供することである。

本稿では、PBMCの生体エネルギーパラメータを測定する方法について説明します。ヒトの血液からPBMCの生体エネルギーを単離、凍結保存、測定する方法を説明します。この方法は、患者の生体エネルギーパラメータを決定し、臨床状況でそれらを評価するために使用できます。これらの測定を適用するには、研究者は新鮮な血液サンプルを採取できる患者集団にアクセスする必要があります。

Protocol

採血、分離、分析に関するこの原稿に記載されているすべてのプロトコルは、ドイツのギーセン大学の治験審査委員会によってレビューおよび承認されています。研究にサンプルを含めることについて、患者の同意が得られました。単離と細胞培養のすべてのステップは、生物学的安全キャビネットの下で行われます。 1.静脈穿刺 消毒スプレー、滅?…

Representative Results

細胞生存率と細胞数単離と凍結保存を成功させるには、細胞数と生存率をできるだけ高くする必要があります。凍結保存の前後に細胞をカウントし、細胞の健康と品質を確保するためにそれらの生存率を決定します。 図3 は、凍結保存前後のPBMCの代表的な説明図であり、細胞数および生存率はほとんど変わらない。これは、PBMC の分離と保存が成功した?…

Discussion

このプロトコルは生体エネルギー分析のために適した方法で人間の血から末梢血の単核細胞(PBMC)を隔離し、cryopreserveする手段を提供する。記載されている方法は、PBMCを穏やかかつ大量に分離する可能性を提供し、高い生存率と生体エネルギー測定のための十分な細胞を備えています。中断が最小限であっても、長時間の単離が発生するという欠点がありますが、その後の凍結保存により、生…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

採血をしてくださったギーセン・マールブルク大学病院の臨床チームに感謝します。この研究はユストゥス・リービッヒ大学から資金提供を受けた。

Materials

0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared
1.01 mM DTBB Self-prepared
10 % Triton X-100 Self-prepared
10 mM Oxalacetat Self-prepared
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made)
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologie. 8 (2), 48 (2019).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

View Video