Cryopreservatie en bio-energetische evaluatie van mononucleaire cellen in menselijk perifeer bloed
Summary
Geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen kunnen worden gebruikt voor de analyse van immuunfuncties en -aandoeningen, stofwisselingsziekten of mitochondriale functies. In dit werk beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de bereiding van PBMC’s uit volbloed en de daaropvolgende cryopreservatie. Cryopreservatie maakt deze tijd en plaats onafhankelijk.
Abstract
De fysiologische functies van eukaryote cellen zijn afhankelijk van energie die voornamelijk wordt geleverd door mitochondriën. Mitochondriale disfunctie wordt in verband gebracht met stofwisselingsziekten en veroudering. Oxidatieve fosforylering speelt een doorslaggevende rol, omdat het cruciaal is voor het behoud van energetische homeostase. PBMC’s zijn geïdentificeerd als een minimaal invasief monster om de mitochondriale functie te meten en er is aangetoond dat ze ziektetoestanden weerspiegelen. De meting van de mitochondriale bio-energetische functie kan echter worden beperkt door verschillende factoren in menselijke monsters. Beperkingen zijn het aantal genomen monsters, de bemonsteringstijd, die vaak over meerdere dagen wordt gespreid, en de locaties. Cryopreservatie van de verzamelde monsters kan zorgen voor een consistente verzameling en meting van monsters. Er moet voor worden gezorgd dat de gemeten parameters vergelijkbaar zijn tussen gecryopreserveerde en vers bereide cellen. Hier beschrijven we methoden voor het isoleren en cryopreservatie van PBMC’s uit menselijke bloedmonsters om de bio-energetische functie van de mitochondriën in deze cellen te analyseren. PBMC gecryopreserveerd volgens het hier beschreven protocol vertoont slechts kleine verschillen in celaantal en levensvatbaarheid, adenosinetrifosfaatspiegels en gemeten ademhalingsketenactiviteit in vergelijking met vers geoogste cellen. Voor de beschreven preparaten is slechts 8-24 ml menselijk bloed nodig, waardoor het mogelijk is om tijdens klinische onderzoeken multicentraal monsters te verzamelen en hun bio-energetica ter plaatse te bepalen.
Introduction
Menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) worden gebruikt voor verschillende toepassingen op vele wetenschappelijke gebieden, waaronder de studie van immunologische en bio-energetische problemen, zoals die met betrekking tot verouderingsprocessen of degeneratieve ziekten 1,2. PBMC’s zijn heterogeen van samenstelling en bestaan uit lymfocyten (B-cellen, T-cellen en NK-cellen), monocyten en dendritische cellen. De cellen vertonen soms grote individuele verschillen en variaties binnen een proefpersoon, dus gestandaardiseerde procedures voor het hanteren van deze cellen zijn vereist. Belangrijke parameters zoals levensvatbaarheid en zuiverheid van de isolatie zijn de basisvereisten voor de behandeling ervan en worden bovendien beïnvloed door omgevingsfactoren zoals het tijdstip van verzameling, het melatoninegehalte, of de proefpersoon nuchter is en andere 3,4.
Op basis van studies naar bio-energetica van PBMC’s beschrijven we hier een methode voor het isoleren, cryopreservatie en kweken van PBMC’s die ook geschikt is voor andere methoden. Hoewel spierbiopsie wordt beschouwd als de gouden standaard voor mitochondriaal energiemetabolisme5, is het onderzoek van bloedcellen een snelle, minimaal invasieve procedure. Daarnaast suggereren steeds meer studies dat de veranderingen in de mitochondriale functie bij veroudering en de ziekte van Alzheimer (AD) niet alleen in de hersenen voorkomen, maar ook in de periferie 6,7,8,9,10. De methode maakt ook onderzoek mogelijk naar andere aandoeningen en ziekten, waaronder diabetes mellitus en obesitas 11,12,13. Genexpressiepatronen bij patiënten met multiple sclerose kunnen worden geanalyseerd, of de immuunfunctie en de invloed daarop in het algemeen 14,15,16.
PBMC’s vertrouwen over het algemeen op oxidatieve fosforylering (OXPHOS) om adenosinetrifosfaat (ATP) te genereren17,18. Daarom bestrijken PBMC’s een breed scala aan toepassingen als surrogaten. In eerdere rapporten is het energiemetabolisme van PBMC’s gebruikt om orgaandisfuncties aan te pakken, zoals bij vroeg hartfalen19, septische shock20 of geslachtsgerelateerde verschillen4 in de mitochondriale functie. Een veralgemeende methode voor cryopreservatie, isolatie en kweek van PBMC’s zou voordelen hebben bij de vergelijkbaarheid van resultaten die in verschillende instituten zijn verkregen. Er is veel variatie in de protocollen voor elke stap21,22, het doel van deze methode is om een richtlijn te bieden voor bio-energetische metingen in PBMC’s.
In dit artikel beschrijven we een methode voor het meten van bio-energetische parameters in PBMC’s. We leggen de methoden uit voor het isoleren, cryopreservatie en meten van bio-energetica van PBMC’s uit menselijk bloed. Deze methode kan worden gebruikt om bio-energetische parameters bij patiënten te bepalen en deze in een klinische context te evalueren. Om deze metingen toe te passen, hebben onderzoekers toegang nodig tot een patiëntenpopulatie waaruit verse bloedmonsters kunnen worden verkregen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een middel om perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC’s) uit menselijk bloed te isoleren en te cryopreservatie op een manier die geschikt is voor bio-energetische analyses. De beschreven methode biedt de mogelijkheid om PBMC’s voorzichtig en in grote hoeveelheden te isoleren, met een hoge levensvatbaarheid en voldoende cellen voor bio-energetische metingen. Het heeft het nadeel dat zelfs met minimale onderbrekingen lange isolaties optreden, maar dat de daaropvolgende cryopreservatie een tijdonafhankel…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen het klinische team van het Universitair Ziekenhuis Giessen-Marburg bedanken voor de bloedafname. Dit werk werd gefinancierd door de Justus Liebig universiteit.
Materials
| 0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) | Self-prepared | – | |
| 0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer | Self-prepared | – | |
| 1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) | Self-prepared | – | |
| 1.01 mM DTBB | Self-prepared | – | |
| 10 % Triton X-100 | Self-prepared | – | |
| 10 mM Oxalacetat | Self-prepared | – | |
| 14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly | Sarstedt | 156353_v | |
| 37% HCl | Carl Roth GmbH & Co. KG | – | |
| 70% Ethanol (EtOH) | Self-prepared | – | |
| Acetyl-CoA | Pancreac Applichem | A3753 | |
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | |
| Alcohol wipes | (70% isopropyl alcohol) | ||
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Aqua (bidest.) | With MilliQ Academic (self-made) | – | |
| Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | |
| ATP-Standard | Sigma-Aldrich | 6016949 | |
| Biocoll Seperating Solution | Biochrom | 6115 | |
| Biological safty cabinet MSC Advantage | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cell counter TC20 Automated Cell Counter | Bio-Rad | ||
| Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 1450016 | |
| Cryotube Cryo.S | Grainer Bio-One | 126263-2DG | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | 37008 | |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | Merck | 102952 | |
| Disinfection spray | |||
| Disposable gloves latex, rubber, or vinyl. | |||
| Distrips (12.5 ml) DistriTips | Gilson | F164150 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) | Gibco (Thermo Scientific) | 15217168 | |
| Ethanol (EtOH 100%) | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9065.3 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Frezer (-80°C) | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Glutamate | Sigma-Aldrich | G1626 | |
| Holder/adapter | |||
| Incubator Midi 40 CO2 | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Injection syringe | Hamilton | ||
| Malate | Sigma-Aldrich | M-1000 | |
| MIR05 | Self-prepared | – | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific Inc. | 10110051 | |
| Multireader CLARIOstar | BMG Labtech | ||
| Nitrogen tank Locator 6 plus | Thermo Fisher Scientific Inc. | ||
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | – | |
| Oxygraph-2k | Orobororus Instruments | ||
| Penicillin-Streptomycin | PAA | 15140122 | |
| Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL | VWR | ||
| Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) | Gibco (Thermo Scientific) | 11530586 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saccharose | Carl ROTH GmbH & Co. KG | 9286.2 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Tetramethylphenylendiamin (TMPD) | Sigma-Aldrich | T3134 | |
| Tourniquet/ Blood pressure cuff | |||
| Tris(hydroxymethyl)amino-methane | Sigma-Aldrich | 108382 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 108643 | |
| Trypanblau | Biochrom | T6146 | |
| Vacuum pump | Vaccubrand GmbH & Co. | ||
| ViewPlate-96 | Perkin Elmer | 6005181 | |
| Water bath WNB22 | Memmert GmbH & Co. KG |
References
- Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
- Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologie. 8 (2), 48 (2019).
- Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
- Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
- Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
- Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
- Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
- Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
- Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
- Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
- Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
- Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
- Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
- Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
- Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
- Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
- Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
- Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
- Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
- Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
- Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
- Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
- Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).
