Summary

שימור קריוגני והערכה ביואנרגטית של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי אנושי

Published: October 20, 2023
doi:

Summary

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים מבודדים יכולים לשמש לניתוח של תפקודים והפרעות חיסוניות, מחלות מטבוליות או תפקודים מיטוכונדריאליים. בעבודה זו, אנו מתארים שיטה סטנדרטית להכנת PBMCs מדם שלם ושימור בהקפאה לאחר מכן. שימור בהקפאה הופך את הזמן והמקום הזה לעצמאיים.

Abstract

התפקודים הפיזיולוגיים של תאים אאוקריוטים מסתמכים על אנרגיה המסופקת בעיקר על ידי מיטוכונדריה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות מטבוליות ולהזדקנות. זרחן חמצוני משחק תפקיד מכריע, שכן הוא חיוני לשמירה על הומאוסטזיס אנרגטי. PBMCs זוהו כמדגם זעיר פולשני למדידת תפקוד המיטוכונדריה והוכחו כמשקפים מצבי מחלה. עם זאת, מדידת התפקוד הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה יכולה להיות מוגבלת על ידי מספר גורמים בדגימות אנושיות. המגבלות הן כמות הדגימות שנלקחו, זמן הדגימה, אשר לעתים קרובות מפוזר על פני מספר ימים, ומיקומים. שימור בהקפאה של הדגימות שנאספו יכול להבטיח איסוף ומדידה עקביים של דגימות. יש להקפיד על כך שהפרמטרים שנמדדו דומים בין תאים משומרים בהקפאה לבין תאים טריים. במאמר זה אנו מתארים שיטות לבידוד ושימור PBMCs בהקפאה מדגימות דם אנושיות כדי לנתח את התפקוד הביו-אנרגטי של המיטוכונדריה בתאים אלה. PBMC נשמר בהקפאה על פי הפרוטוקול המתואר כאן מראה רק הבדלים קלים במספר התאים וביכולת הכדאיות, ברמות אדנוזין טריפוספט ובפעילות שרשרת הנשימה שנמדדה בהשוואה לתאים שזה עתה נקטפו. רק 8-24 מ”ל של דם אנושי נדרש עבור ההכנות המתוארות, מה שמאפשר לאסוף דגימות במהלך מחקרים קליניים multicentral ולקבוע bioenergetics שלהם באתר.

Introduction

תאי דם חד-גרעיניים היקפיים אנושיים (PBMCs) משמשים ליישומים שונים בתחומים מדעיים רבים, כולל חקר נושאים אימונולוגיים וביו-אנרגטיים, כגון אלה הקשורים לתהליכי הזדקנות או מחלות ניווניות 1,2. PBMCs הם הטרוגניים בהרכבם ומורכבים מלימפוציטים (תאי B, תאי T ותאי NK), מונוציטים ותאים דנדריטיים. התאים מראים לפעמים הבדלים אינדיבידואליים גדולים ווריאציות בתוך נושא, ולכן נדרשים נהלים סטנדרטיים לטיפול בתאים אלה. פרמטרים חשובים כמו כדאיות וטוהר הבידוד הם הדרישות הבסיסיות לטיפול בו ומושפעים גם מגורמים סביבתיים כמו זמן האיסוף, רמת המלטונין, האם הנבדק בצום ועוד 3,4.

בהתבסס על מחקרים על ביו-אנרגטיקה של PBMCs, אנו מתארים כאן שיטה לבידוד, שימור הקפאה וטיפוח של PBMCs המתאימה גם לשיטות אחרות. בעוד שביופסיה של שריר נחשבת לתקן הזהב למטבוליזם של אנרגיה מיטוכונדריאלית5, בדיקת תאי הדם היא הליך מהיר וזעיר פולשני. בנוסף לכך, יותר ויותר מחקרים מצביעים על כך שהשינויים בתפקוד המיטוכונדריה בהזדקנות ובאלצהיימר מתרחשים לא רק במוח אלא גם בפריפריה 6,7,8,9,10. השיטה מאפשרת גם חקירות של מצבים ומחלות אחרות, כולל סוכרת והשמנת יתר 11,12,13. ניתן לנתח דפוסי ביטוי גנים בחולי טרשת נפוצה, או תפקוד מערכת החיסון והשפעותיו עליה באופן כללי 14,15,16.

PBMCs בדרך כלל מסתמכים על זרחן חמצוני (OXPHOS) כדי לייצר אדנוזין טריפוספט (ATP)17,18. לכן, PBMCs מכסים מגוון רחב של יישומים כפונדקאיות. בדוחות קודמים, חילוף החומרים האנרגטי של PBMCs שימש לטיפול בתפקוד לקוי של איברים, כגון אי ספיקת לב מוקדמת19, הלם ספטי20 או הבדלים הקשורים למין4 בתפקוד המיטוכונדריה. לשיטה כללית לבידוד הקפאה וטיפוח של PBMCs יהיו יתרונות בהשוואת התוצאות המתקבלות במכונים שונים. קיימת שונות רבה בפרוטוקולים עבור כל שלב21,22, מטרת שיטה זו היא לספק קו מנחה למדידות ביו-אנרגטיות במרכזיות.

במאמר זה נתאר שיטה למדידת פרמטרים ביו-אנרגטיים במרכזיות. אנו מסבירים את השיטות לבידוד, שימור ומדידה של ביו-אנרגטיקה של PBMCs מדם אנושי. שיטה זו יכולה לשמש כדי לקבוע פרמטרים ביו-אנרגטיים בחולים ולהעריך אותם בהקשר קליני. כדי ליישם מדידות אלה, החוקרים זקוקים לגישה לאוכלוסיית חולים שממנה ניתן לקבל דגימות דם טריות.

Protocol

כל הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה לאיסוף, בידוד וניתוח דם נבדקו ואושרו על ידי מועצת הביקורת המוסדית באוניברסיטת גיסן, גרמניה. התקבלה הסכמת החולים לכלול את הדגימות שלהם במחקר. כל שלבי הבידוד ותרבית התאים מתבצעים תחת ארון בטיחות ביולוגי. 1. דיקור הכינו את כל הצ?…

Representative Results

כדאיות התא ומספרו;כדי להשיג בידוד מוצלח ושימור בהקפאה, ספירת התאים והכדאיות צריכות להיות גבוהות ככל האפשר. לפני ואחרי שימור בהקפאה, התאים נספרים, ויכולת הקיום שלהם נקבעת כדי להבטיח את בריאותם ואיכותם של התאים. איור 3 הוא המחשה מייצגת של PBMCs לפני ואחרי שימור בהקפא…

Discussion

פרוטוקול זה מספק אמצעי לבידוד ושימור בהקפאה של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מדם אנושי באופן המתאים לאנליזות ביו-אנרגטיות. השיטה המתוארת מציעה אפשרות לבודד PBMCs בעדינות ובכמויות גדולות, עם כדאיות גבוהה ותאים מספיקים למדידות ביו-אנרגטיות. יש לו את החיסרון כי אפילו עם הפרעות מינימליות, ביד?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לצוות הקליני של בית החולים האוניברסיטאי גיסן-מרבורג על איסוף הדם. עבודה זו מומנה על ידי אוניברסיטת יוסטוס ליביג.

Materials

0.1 M Triethanolamine-HCl-Buffer (pH = 8,0) Self-prepared
0.5 M Triethanolamine-HCl-Buffer Self-prepared
1.0 M Tris-HCl-Buffer (pH = 8,1) Self-prepared
1.01 mM DTBB Self-prepared
10 % Triton X-100 Self-prepared
10 mM Oxalacetat Self-prepared
14–20 G sterile blood draw needles Multi Adapter Sarstedt Safety-Multifly Sarstedt 156353_v
37% HCl Carl Roth GmbH & Co. KG
70% Ethanol (EtOH) Self-prepared
Acetyl-CoA Pancreac Applichem A3753
ADP Sigma-Aldrich A5285
Alcohol wipes  (70% isopropyl alcohol)
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Aqua (bidest.) With MilliQ Academic (self-made)
Ascorbate Sigma-Aldrich A4034
ATP-Standard Sigma-Aldrich 6016949
Biocoll Seperating Solution Biochrom 6115
Biological safty cabinet MSC Advantage Thermo Fisher Scientific Inc.
Carbonylcyanid-p-trifluoromethoxy-phenylhydrazon (FCCP) Sigma-Aldrich C2920
Cell counter TC20 Automated Cell Counter Bio-Rad
Centrifuge Heraeus Megafuge 16 R Thermo Fisher Scientific Inc.
Counting slides, dual chamber for cell counter Bio-Rad 1450016
Cryotube Cryo.S Grainer Bio-One 126263-2DG
Digitonin Sigma-Aldrich 37008
Dimethylsulfoxid (DMSO) Merck 102952
Disinfection spray
Disposable gloves latex, rubber, or vinyl.
Distrips (12.5 ml) DistriTips Gilson F164150
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS; 10x) Gibco (Thermo Scientific) 15217168
Ethanol (EtOH 100%) Carl ROTH GmbH & Co. KG 9065.3
Fetal bovine serum (FBS) Sigma-Aldrich F9665
Frezer (-80°C) Thermo Fisher Scientific Inc.
Glutamate Sigma-Aldrich G1626
Holder/adapter 
Incubator Midi 40 CO2 Thermo Fisher Scientific Inc.
Injection syringe Hamilton
Malate Sigma-Aldrich M-1000
MIR05 Self-prepared
Mr. Frosty Freezing Container Thermo Fisher Scientific Inc. 10110051
Multireader CLARIOstar BMG Labtech
Nitrogen tank Locator 6 plus Thermo Fisher Scientific Inc.
Oligomycin Sigma-Aldrich O4876
Oxalacetate Sigma-Aldrich
Oxygraph-2k Orobororus Instruments
Penicillin-Streptomycin PAA 15140122
Pipettes Performance Pipettor 10 μL, 100 μL, 1000 μL VWR
Roswell-Park. Memorial-Institute-Medium (RPMI-1640) Gibco (Thermo Scientific) 11530586
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Saccharose Carl ROTH GmbH & Co. KG 9286.2
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Succinate Sigma-Aldrich S2378
Tetramethylphenylendiamin (TMPD) Sigma-Aldrich T3134
Tourniquet/ Blood pressure cuff
Tris(hydroxymethyl)amino-methane Sigma-Aldrich 108382
Triton X-100 Sigma-Aldrich 108643
Trypanblau Biochrom T6146
Vacuum pump Vaccubrand GmbH & Co.
ViewPlate-96 Perkin Elmer 6005181
Water bath WNB22 Memmert GmbH & Co. KG

References

  1. Mancuso, M., et al. Mitochondria, cognitive impairment, and Alzheimer’s disease. Int J Alzheimers Dis. 2009, 951548 (2009).
  2. Haas, R. H. Mitochondrial dysfunction in aging and diseases of aging. Biologie. 8 (2), 48 (2019).
  3. Kleiveland, C. R., Verhoeckx, K., Cotter, P., Lopez-Exposito, I., et al. Peripheral blood mononuclear cells. The Impact of Food Bioactives on Health. In Vitro and Ex Vivo Models. , (2015).
  4. Silaidos, C., et al. Sex-associated differences in mitochondrial function in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and brain. Biol Sex Differ. 9 (1), 34 (2018).
  5. Acin-Perez, R., Benincá, C., Shabane, B., Shirihai, O. S., Stiles, L. Utilization of human samples for assessment of mitochondrial bioenergetics: Gold standards, limitations, and future perspectives. Life. 11 (9), 949 (2021).
  6. Schindowski, K., et al. Impact of aging. NeuroMol Med. 4 (3), 161-177 (2003).
  7. Migliore, L., et al. Searching for the role and the most suitable biomarkers of oxidative stress in Alzheimer’s disease and in other neurodegenerative diseases. Neurobiol Aging. 26 (5), 587-595 (2005).
  8. Leutz, S., et al. Reduction of trophic support enhances apoptosis in PC12 cells expressing Alzheimer’s APP mutation and sensitizes cells to staurosporine-induced cell death. J Mol Neurosci. 18 (3), 189-201 (2002).
  9. Leuner, K., et al. Peripheral mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease: Focus on lymphocytes. Mol Neurobiol. 46 (1), 194-204 (2012).
  10. Leuner, K., et al. Enhanced apoptosis, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in lymphocytes as potential biomarkers for Alzheimer’s disease. J Neural Transm Suppl. 2007 (72), 207-215 (2007).
  11. Kartika, R., Wibowo, H., Purnamasari, D., Pradipta, S., Larasati, R. A. Altered Indoleamine 2,3-Dioxygenase production and its association to inflammatory cytokines in peripheral blood mononuclear cells culture of type 2 diabetes mellitus. Int J Tryptophan Res. 13, 1178646920978236 (2020).
  12. Cortez-Espinosa, N., et al. CD39 expression on Treg and Th17 cells is associated with metabolic factors in patients with type 2 diabetes. Hum Immunol. 76 (9), 622-630 (2015).
  13. Mahmoud, F., et al. Effect of Diabetea tea ™ consumption on inflammatory cytokines and metabolic biomarkers in type 2 diabetes patients. J Ethnopharmacol. 194, 1069-1077 (2016).
  14. Volman, J. J., Ramakers, J. D., Plat, J. Dietary modulation of immune function by β-glucans. Physiol Behav. 94 (2), 276-284 (2008).
  15. Reddy, M., Eirikis, E., Davis, C., Davis, H. M., Prabhakar, U. Comparative analysis of lymphocyte activation marker expression and cytokine secretion profile in stimulated human peripheral blood mononuclear cell cultures: an in vitro model to monitor cellular immune function. J Immunol Methods. 293 (1), 127-142 (2004).
  16. Otaegui, D., et al. Differential micro RNA expression in PBMC from multiple sclerosis patients. PLoS One. 4 (7), e6309 (2009).
  17. Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
  18. Fox, C. J., Hammerman, P. S., Thompson, C. B. Fuel feeds function: energy metabolism and the T-cell response. Nat Rev Immunol. 5 (11), 844-852 (2005).
  19. Li, P., et al. Mitochondrial respiratory dysfunctions of blood mononuclear cells link with cardiac disturbance in patients with early-stage heart failure. Sci Rep. 5, 10229 (2015).
  20. Weiss, S. L., et al. Mitochondrial dysfunction in peripheral blood mononuclear cells in pediatric septic shock. Pediatr Crit Care Med. 16 (1), e4-e12 (2015).
  21. Higdon, L. E., Lee, K., Tang, Q., Maltzman, J. S. Virtual global transplant laboratory standard operating procedures for blood collection, PBMC isolation, and storage. Transplant Direct. 2 (9), e101 (2016).
  22. Betsou, F., Gaignaux, A., Ammerlaan, W., Norris, P. J., Stone, M. Biospecimen science of blood for peripheral blood mononuclear cell (PBMC) functional applications. Curr Pathobiol Rep. 7, 17-27 (2019).
  23. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  24. Djafarzadeh, S., Jakob, S. M. High-resolution respirometry to assess mitochondrial function in permeabilized and intact cells. J Vis Exp. (120), e54985 (2017).
  25. Wang, W., Zhao, F., Ma, X., Perry, G., Zhu, X. Mitochondria dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer’s disease: recent advances. Mol Neurodegener. 15 (1), 30 (2020).
  26. Chaturvedi, R. K., Flint Beal, M. Mitochondrial diseases of the brain. Free Radic Biol Med. 63, 1-29 (2013).

Play Video

Citer Cet Article
Dieter, F., Grube, J., Birkenhauer, T., Quentin, A., Eckert, G. P. Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells. J. Vis. Exp. (200), e65730, doi:10.3791/65730 (2023).

View Video