Summary

Выявление антител IgG и IgM к бешенству с помощью непрямого флуоресцентного теста на антитела к бешенству

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

Целью данной статьи является изучение использования теста на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству для выявления антител IgG и IgM, специфичных для бешенства.

Abstract

Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) был разработан для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Этот тест дает быстрые результаты и может быть использован для обнаружения антител к бешенству в нескольких различных сценариях. Тест на бешенство IFA особенно полезен для быстрого и раннего выявления антител для оценки иммунного ответа у пациента, у которого развилось бешенство. Несмотря на то, что другие методы посмертной диагностики бешенства имеют приоритет, этот тест может быть использован для демонстрации недавнего контакта с вирусом бешенства путем обнаружения антител. Тест IFA не дает титра вируснейтрализующих антител (VNA), но ответ на доконтактную профилактику (ДКП) можно оценить по положительному или отрицательному наличию антител. Этот тест может быть использован в различных ситуациях и может дать результаты для ряда различных целей. В этом исследовании мы использовали несколько парных образцов сыворотки крови людей, получавших ДКП и продемонстрировавших наличие у них антител к бешенству с течением времени с помощью теста IFA.

Introduction

Тест на непрямые флуоресцентные антитела к бешенству (ИФА) используется для выявления различных изотипов антител, специфичных для бешенства, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости. Это один из арсенала тестов, доступных для наблюдения за посмертным пациентом с бешенством. Это особенно полезно для раннего выявления антител для оценки иммунного ответа пациента на инфекцию бешенства. При использовании в сочетании с другими тестами, историей болезни и статусом вакцинации пациента тест IFA может помочь определить контакт с вирусом бешенства или вакциной1. Поскольку тест IFA измеряет IgM и/или IgG, значения специфических антител могут указывать на приблизительные временные рамки с момента контакта с антигеном1. Этот тест может быть полезен в перечисленных приложениях или других, которые еще не изучены.

Существует несколько серологических тестов на бешенство. Основными методами измерения нейтрализующих антител к вирусу бешенства (РВНК) являются экспресс-тест на ингибирование флуоресцентного фокуса (RFFIT), тест на нейтрализацию вируса бешенства (FAVN) или их модификации. Однако эти тесты не дифференцируют антитела IgM и IgG. Когда дифференциация изотипа антител важна для мониторинга иммунного ответа на бешенство, используются тесты на ИФА бешенства и иммуноферментный анализ на бешенство (ИФА), но они не измеряют РВНК. Несмотря на то, что тесты IFA и ELISA могут быть использованы для определения наличия антител, специфичных для бешенства, в образце существуют некоторые различия в том, как они выполняются. В тесте IFA в качестве антигенного субстрата используется живой вирус, культивируемый в клетках, в то время как типичный ИФА для выявления бешенства использует один или несколько вирусных белков. В лабораторных условиях, где вирус бешенства может быть культивирован, тест IFA может быть более простым вместо покупки или культивирования отдельных вирусных белков для ИФА. Цель тестирования и информация, полученная из результатов любого серологического анализа на бешенство, должны учитываться при принятии решения о том, какой из нихвыбрать.

IgM реагирует первым, увеличиваясь до тех пор, пока не будет наблюдаться смена класса примерно на 28-й день, после чего IgG становится преобладающим циркулирующим антителом3. Следовательно, IgM можно ожидать только в течение ограниченного периода времени после контакта с вирусом бешенства или вакцинации. Тестирование как сыворотки, так и спинномозговой жидкости (ликвора) может показать, был ли контакт через вакцинацию, при которой антитела будут видны только в сыворотке, или от вирусной инфекции, которая потенциально может показать антитела в спинномозговой жидкости1.

Установлено, что антитела к бешенству сохраняются в течение нескольких лет после доконтактной профилактики (ДКП)4. Тест IFA может быть полезным инструментом, чтобы продемонстрировать это в различные моменты времени после вакцинации или контакта.

Protocol

Следующий протокол был одобрен для этичного использования образцов на людях Центром Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк для разработки анализов, номер одобрения протокола #03-019. 1. Безопасность Наденьте средства индивидуальной защиты (С?…

Representative Results

Все образцы сыворотки крови были взяты у пациентов примерно в те же сроки после приема ДКП. Образцы были протестированы от пяти разных пациентов в следующие моменты времени: через 2 недели после последней прививки вакцины против бешенства, через 6 месяцев после серии вакцинации против б…

Discussion

В тесте IFA используется комплекс антиген-антитело, позволяющий визуализировать антитела, специфичные для бешенства. Клетки нейробластомы или BHK высевают на предметные стекла микроскопа с многолуночным покрытием из ПТФЭ и инокулируют лабораторным штаммом вируса бешенства CVS-11. После т?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны Центру Уодсворта Департамента здравоохранения штата Нью-Йорк за поддержку этого проекта.

Materials

25x55mm glass cover slips Any
Acetone Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate Sigma-Aldrich F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate SeraCare 5230-0286
Aspirating pipette tip Any
BHK-21 Cells ATCC CCL-10
BION IFA Diluent MBL BION DIL-9993
Cell Culture water Sigma-Aldrich W3500 EGM
Coplin Jars Any
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F2442 EGM
Fluorescent microscope with FITC filter Any
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent Fisher Scientific 23-043-158 IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine Sigma-Aldrich G-7513 EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate Sigma-Aldrich M0643 EGM
Mouse Neuroblastoma Cells ATCC CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides Any
PBS Any pH 7.6 
Penicillin Sigma P-3032 EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate Millipore Sigma 5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761 EGM
Sodium Chloride crystals Sigma-Aldrich S5886 Mountant
Sterile dropper Any
Streptomycin sulfate salt Sigma S9137 EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0 Sigma-Aldrich S9693 Mountant
Tryptose Phosphate Broth BD 260300 EGM
Vitamin mix Sigma-Aldrich M6895 EGM

References

  1. Rupprecht, C. E., Fooks, A. R., Abela-Ridder, B. Laboratory Techniques in Rabies. Volume 1. World Health Organization. , 232-245 (2018).
  2. Moore, S. M. Challenges of rabies serology: defining context of interpretation. Viruses. 13 (8), 1516 (2021).
  3. Zajac, M. D. Development and evaluation of a rabies enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) targeting IgM and IgG in human sera. Viruses. , 40-49 (2019).
  4. Mills, D. J., Lau, C. L., Mills, C., Furuya-Kanamori, L. Long-term persistence of antibodies and boostability after rabies intradermal pre-exposure prophylaxis. Journal of Travel Medicine. 29 (2), (2022).
  5. Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Journal of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
  6. Rudd, R. J., Appler, K. A., Wong, S. J. Presence of cross-reactions with other viral encephalitides in the indirect fluorescent-antibody test for diagnosis of rabies. Journal of Clinical Microbiology. 51 (12), 4079-4082 (2013).
  7. Fooks, A. R., Jackson, A. C. . Rabies: scientific basis of the disease and its management. , (2020).
  8. Paldanius, M., Bloigu, A., Leinonen, M., Saikku, P. Measurement of Chlamydia pneumoniae-specific immunoglobulin A (IgA) antibodies by the microimmunofluorescence (MIF) method: comparison of seven fluorescein-labeled anti-human IgA conjugates in an in-house MIF test using one commercial MIF and one enzyme immunoassay kit. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 10 (1), 8-12 (2003).
  9. Rodriguez, M. C., Fontana, D., Garay, E., Prieto, C. Detection and quantification of anti-rabies glycoprotein antibodies: current state and perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105 (18), 6547-6557 (2021).
  10. Katz, I. S. S., Guedes, F., Fernandes, E. R., Dos Ramos Silva, S. Immunological aspects of rabies: a literature review. Archives of Virology. 162 (1), 3251-3268 (2017).
  11. Moore, S. M., Hanlon, C. A. Rabies-specific antibodies: measuring surrogates of protection against a fatal disease. PLoS Neglected Tropical Diseases. 4 (3), 595 (2010).

Play Video

Citer Cet Article
Jones, N. J., Jarvis, J. A., Appler, K. A., Davis, A. D. Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test. J. Vis. Exp. (203), e65459, doi:10.3791/65459 (2024).

View Video