Summary

Detecção de anticorpos IgG e IgM antirrábicos pelo teste de imunofluorescência indireta da raiva

Published: January 19, 2024
doi:

Summary

O objetivo deste artigo é examinar o uso do teste de imunofluorescência indireta da raiva para a detecção de anticorpos IgG e IgM específicos para raiva.

Abstract

O teste de imunofluorescência indireta (RIFI) antirrábica foi desenvolvido para detectar vários isotipos de anticorpos específicos contra a raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. Este teste fornece resultados rápidos e pode ser usado para detectar anticorpos antirrábicos em vários cenários diferentes. O teste de IFA antirrábica é especialmente útil para a detecção rápida e precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune em um paciente que desenvolveu raiva. Embora outros métodos para o diagnóstico antemortem da raiva tenham precedência, este teste pode ser utilizado para demonstrar a exposição recente ao vírus rábico através da detecção de anticorpos. O teste de IFA não fornece um título de anticorpos neutralizantes do vírus (VNA), mas a resposta de profilaxia pré-exposição (PrEP) pode ser avaliada através da presença de anticorpos positivos ou negativos. Este teste pode ser utilizado em várias situações e pode fornecer resultados para vários alvos diferentes. Neste estudo, usamos várias amostras de soro pareadas de indivíduos que receberam PrEP e demonstramos sua presença de anticorpos antirrábicos ao longo do tempo usando o teste de RIFI.

Introduction

O teste de anticorpos fluorescentes indiretos (RIFI) antirrábicos é usado para detectar vários isotipos de anticorpos específicos da raiva no soro ou no líquido cefalorraquidiano. É um dos muitos testes disponíveis para o acompanhamento de um paciente antirrábico antemortem. É especialmente útil para a detecção precoce de anticorpos para avaliar a resposta imune de um paciente à infecção por raiva. Quando usado em conjunto com outros testes, história do caso e status de vacinação do paciente, o teste de IFA pode ajudar a determinar a exposição ao vírus da raiva ou a uma vacina1. Como o teste de RIFI mede IgM e/ou IgG, os valores do anticorpo específico podem indicar um período de tempo aproximado da exposição ao antígeno1. Esse teste pode ser útil nos aplicativos listados ou em outros ainda não explorados.

Existem vários ensaios sorológicos para raiva disponíveis. O teste rápido de inibição de foco fluorescente (RFFIT), o teste de neutralização do vírus de imunofluorescência (FAVN) ou modificações destes são os principais métodos para medir anticorpos neutralizantes contra o vírus da raiva (RNVR)1. No entanto, esses testes não diferenciam anticorpos IgM e IgG. Quando diferenciar o isotipo de anticorpos é importante no monitoramento da resposta imune da raiva, os testes de IFA antirrábica e ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) da raiva são usados, mas não medem RVNAs. Embora os testes de RIFI e ELISA possam ser usados para determinar a presença de anticorpos específicos contra a raiva em uma amostra, existem algumas diferenças na forma como são executados. O teste de IFA utiliza um vírus vivo cultivado em células como substrato antigênico, enquanto um ELISA típico para detecção de raiva utiliza uma ou mais proteínas virais. Em um ambiente de laboratório onde o vírus da raiva pode ser cultivado, o teste de IFA pode ser mais facilmente realizado em vez de comprar ou cultivar proteínas virais individuais para o ELISA. A finalidade do teste e as informações obtidas a partir dos resultados de qualquer ensaio sorológico antirrábico devem ser consideradas ao determinar qual escolher2.

A IgM é a primeira a responder, aumentando até que a mudança de classe seja observada por volta do 28º dia, quando a IgG se torna o anticorpo circulante predominante3. Assim, a IgM só seria esperada por um período limitado de tempo após a exposição ao vírus da raiva ou à vacinação. O teste do soro e do líquido cefalorraquidiano (LCR) pode indicar se a exposição foi por meio de vacinação, na qual os anticorpos seriam vistos apenas no soro, ou de uma infecção viral, que potencialmente mostraria anticorpos no LCR1.

Foi estabelecido que os anticorpos antirrábicos persistem por vários anos após a profilaxia pré-exposição (PrEP)4. O teste de IFA pode ser uma ferramenta útil para demonstrar isso em diferentes momentos após a vacinação ou exposição.

Protocol

O seguinte protocolo foi aprovado para o uso ético de amostras humanas pelo New York State Department of Health Wadsworth Center para desenvolvimento de ensaios, número de aprovação do protocolo #03-019. 1. Segurança Use equipamentos de proteção individual (EPIs), no mínimo proteção ocular (óculos ou face shield), máscara cirúrgica e luvas sem látex. Certifique-se de que o pessoal está vacinado contra a raiva e que um título de ≥0,5 UI/mL …

Representative Results

Todas as amostras de soro foram coletadas dos pacientes aproximadamente nos mesmos períodos de tempo após a PrEP. As amostras foram testadas de cinco pacientes diferentes nos seguintes momentos: 2 semanas após a inoculação final da vacina antirrábica, 6 meses após a série de vacinas antirrábicas e 18 meses após a série de vacinas antirrábicas. Cada amostra de soro foi diluída em série e graduada para presença de IgM e IgG, conforme descrito nas etapas 5.2 e 5.3 do protocolo. O valor de anticorpos atribuíd…

Discussion

O teste de IFA aproveita um complexo antígeno-anticorpo, permitindo um local de marcação para visualizar anticorpos específicos da raiva. Células de neuroblastoma ou BHK são semeadas em lâminas de microscópio revestidas com PTFE multipoço e inoculadas com a cepa CVS-11 de laboratório do vírus da raiva. Uma vez confluente a monocamada e atingida a infectividade desejada de aproximadamente 50%, as lâminas são armazenadas até ficarem prontas para uso6.

O soro…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Somos gratos ao Wadsworth Center do Departamento de Saúde do Estado de Nova York por apoiar este projeto.

Materials

25x55mm glass cover slips Any
Acetone Any
Anti-Human IgG Labeled Conjugate Sigma-Aldrich F9512
Anti-Human IgM Labeled Conjugate SeraCare 5230-0286
Aspirating pipette tip Any
BHK-21 Cells ATCC CCL-10
BION IFA Diluent MBL BION DIL-9993
Cell Culture water Sigma-Aldrich W3500 EGM
Coplin Jars Any
Fetal Bovine Serum  Sigma-Aldrich F2442 EGM
Fluorescent microscope with FITC filter Any
Glycerol Sigma-Aldrich G7893 Mountant
Gullsorb IgM inactivation reagent Fisher Scientific 23-043-158 IgG Inactivation Reagent
L-Glutamine Sigma-Aldrich G-7513 EGM
Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate Sigma-Aldrich M0643 EGM
Mouse Neuroblastoma Cells ATCC CCL-131
Multi-well Teflon coating glass slides Any
PBS Any pH 7.6 
Penicillin Sigma P-3032 EGM
Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate Millipore Sigma 5100, 5500 or 6500
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S-5761 EGM
Sodium Chloride crystals Sigma-Aldrich S5886 Mountant
Sterile dropper Any
Streptomycin sulfate salt Sigma S9137 EGM
Trizma pre-set crystals pH 9.0 Sigma-Aldrich S9693 Mountant
Tryptose Phosphate Broth BD 260300 EGM
Vitamin mix Sigma-Aldrich M6895 EGM

References

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Citer Cet Article
Jones, N. J., Jarvis, J. A., Appler, K. A., Davis, A. D. Detection of Rabies IgG and IgM Antibodies Using the Rabies Indirect Fluorescent Antibody Test. J. Vis. Exp. (203), e65459, doi:10.3791/65459 (2024).

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