Summary

TACI: Een ImageJ Plugin voor 3D Calcium Imaging Analyse

Published: December 16, 2022
doi:

Summary

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) is een open-source ImageJ-plug-in voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse die beweging op de z-as onderzoekt en de maximale waarde van elke z-stack identificeert om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Het kan neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar op verschillende z-vlakken.

Abstract

Onderzoek in de neurowetenschappen is geëvolueerd om complexe beeldvormings- en computationele hulpmiddelen te gebruiken om uitgebreide informatie uit datasets te extraheren. Calciumbeeldvorming is een veelgebruikte techniek die geavanceerde software vereist om betrouwbare resultaten te verkrijgen, maar veel laboratoria hebben moeite om computationele methoden toe te passen bij het bijwerken van protocollen om aan moderne normen te voldoen. Problemen ontstaan door een gebrek aan programmeerkennis en paywalls voor software. Bovendien vertonen interessante cellen bewegingen in alle richtingen tijdens calciumbeeldvorming. Er zijn veel benaderingen ontwikkeld om de beweging in de laterale (x/y) richting te corrigeren.

Dit artikel beschrijft een workflow met behulp van een nieuwe ImageJ-plug-in, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), om beweging op de z-as in 3D-calciumbeeldvorming te onderzoeken. Deze software identificeert de maximale fluorescentiewaarde van alle z-posities waarin een neuron verschijnt en gebruikt deze om de intensiteit van het neuron op de overeenkomstige t-positie weer te geven. Daarom kan deze tool neuronen scheiden die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar verschijnen op verschillende z-vlakken. Als ImageJ-plug-in is TACI een gebruiksvriendelijke, open-source computationele tool voor 3D-calciumbeeldvormingsanalyse. We hebben deze workflow gevalideerd met behulp van thermosensitieve neuronen van vlieglarven die bewegingen in alle richtingen vertoonden tijdens temperatuurschommelingen en een 3D-calciumbeeldvormingsdataset verkregen van het vliegenbrein.

Introduction

Het niveau van intracellulair calcium is een precieze marker van neuronale prikkelbaarheid. Calciumbeeldvorming meet de veranderingen in intracellulair calcium om neuronale activiteitte begrijpen 1. Studies in de neurowetenschappen hebben deze methode in toenemende mate gebruikt vanwege de ontwikkeling van technieken voor het meten van intracellulaire calciumconcentratie, waaronder genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECIs), zoals GCaMP2,3, die niet-invasief kunnen worden uitgedrukt in specifieke sets neuronen via genetische benaderingen. De lagere kosten van lasers en microscoopcomponenten hebben ook het gebruik van calciumbeeldvorming4 verhoogd. Belangrijk is dat calciumbeeldvorming het mogelijk maakt om afzonderlijke neuronen en grote neuronpopulaties tegelijkertijd te registreren en te bestuderen in vrij bewegende dieren5.

Niettemin is de analyse van calciumbeeldvormingsgegevens een uitdaging omdat (1) het gaat om het volgen van de veranderingen in fluorescentie van individuele cellen in de loop van de tijd, (2) het fluorescentiesignaal met tussenpozen verdwijnt of opnieuw verschijnt met neuronale reacties, en (3) de neuronen in alle richtingen kunnen bewegen, met name in en uit een brandpuntsvlak of verschijnen op meerdere vlakken4, 6. Handmatige analyse is tijdrovend en wordt onpraktisch naarmate de lengte van opnames en het aantal neuronen toeneemt. Er zijn verschillende softwareprogramma’s ontwikkeld om het proces van het analyseren van calciumbeeldvorming te versnellen. Voorheen werd software ontworpen in een beperkte experimentele context, waardoor het voor andere laboratoria moeilijk was om het te adopteren. Recente inspanningen om te voldoen aan moderne normen voor het delen van software hebben geleid tot de ontwikkeling van verschillende tools die consistent calciumbeeldvormingsgegevens kunnen analyseren in verschillende groepen 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . De meeste van deze tools vereisen echter programmeerkennis en/of zijn afhankelijk van commerciële software. Een gebrek aan programmeerkennis en software paywalls weerhouden onderzoekers ervan om deze methoden toe te passen. Bovendien richten veel van deze tools zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd en gecorrigeerd6. Er is behoefte aan een computationeel hulpmiddel om 3D-calciumbeeldvorming te analyseren die zich richt op neuronen die z-drift vertonen en op meerdere z-vlakken verschijnen. Idealiter zou deze tool open-source software moeten gebruiken en geen programmeerkennis vereisen om andere laboratoria in staat te stellen het gemakkelijk te adopteren.

Hier hebben we een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, ontwikkeld om 3D-calciumbeeldvormingsgegevens te analyseren. Eerst hernoemt de software, indien nodig, en organiseert de 3D-calciumbeeldvormingsgegevens op z-posities. De cellen van belang worden gevolgd in elke z-positie en hun fluorescentie-intensiteiten worden geëxtraheerd door TrackMate of andere computationele hulpmiddelen. TACI wordt vervolgens toegepast om de beweging op de z-as te onderzoeken. Het identificeert de maximale waarde van een z-stack en gebruikt deze om de intensiteit van een cel op het overeenkomstige tijdstip weer te geven. Deze workflow is geschikt voor het analyseren van 3D-calciumbeeldvorming met beweging in alle richtingen en / of met neuronen die elkaar overlappen in de laterale (x / y) richting, maar in verschillende z-posities verschijnen. Om deze workflow te valideren, werden 3D-calciumbeeldvormingsdatasets van thermosensitieve neuronen van vliegenlarven en paddenstoelneuronen in de hersenen gebruikt. Van belang is dat TACI een open-source ImageJ-plug-in is en geen programmeerkennis vereist.

Protocol

1. Calciumbeeldvorming Voorbereiding van vliegenlarvenOPMERKING: Vliegen en larven worden bij 25 °C gehouden onder een licht-donkercyclus van 12 uur:12 uur.Verdoof de vliegen met CO2. Sorteer 20-45 mannetjes en 20-45 vrouwtjes in elke vliegenflacon en geef ze ten minste 24 uur tot 48 uur om te herstellen van de CO2-blootstelling .OPMERKING: Blootstelling van vliegen aan CO2 moet zo kort mogelijk duren. Om de leeftijd van de larven te …

Representative Results

Workflow van 3D calcium imaging analyseIn deze studie ontwikkelden we een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, en beschreven we een workflow om z-drift te volgen en 3D-calciumbeeldvorming te analyseren die de reacties van individuele cellen in meerdere z-posities aangeeft (figuur 1). Deze tool heeft vier functies: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT en MERGE. Ten eerste, als de afbeeldingsnamen niet compatibel zijn met de…

Discussion

Deze studie ontwikkelde een nieuwe ImageJ-plug-in, TACI, en beschreef een workflow die 3D-calciumbeeldvorming analyseert. Veel momenteel beschikbare tools richten zich op het corrigeren van de x/y-beweging, hoewel beweging op de z-as ook expliciet moet worden gediagnosticeerd of gecorrigeerd6. Tijdens beeldacquisitie in een levend organisme is beweging op de z-as onvermijdelijk, zelfs wanneer het organisme is geïmmobiliseerd, en sommige stimuli, zoals temperatuurverandering, veroorzaken vaak aanz…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Een Zeiss LSM 880 in het Fralin Imaging Center werd gebruikt om de calciumbeeldvormingsgegevens te verzamelen. We erkennen Dr. Michelle L Olsen en Yuhang Pan voor hun hulp met de IMARIS-software. We erkennen Dr. Lenwood S. Heath voor constructieve opmerkingen over het manuscript en Steven Giavasis voor opmerkingen over het GitHub README-bestand. Dit werk werd ondersteund door NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) en NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) aan L.N. De financiers hadden geen rol in het studieontwerp, de gegevensverzameling en -analyse, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Materials

Blunt Fill Needel BD 303129
Calcium chloride dihydrate Fisher Scientific  10035-04-8 Fly food ingredient
Carbon dioxide Airgas UN1013 Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit Genesee 59-180
Confocal microscope LSM880 Zeiss 4109002107876000 An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software Measurement Computing
Dextrose Genesee 62-113 Fly food ingredient
Drosophila Agar Genesee 66-111 Fly food ingredient
Ethanol Decon Labs, Inc. 64-17-5 Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80 Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4 Dr. Aravinthan DT Samuel lab A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4 Dr. Paul Garrity lab A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6 Bloomington Drosophila Stock Center 42750
Flypad Genesee 59-114
General purpose forged brass regulator Gentec G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x) Thermo Fisher Scientific 10010-031
Green Drosophila tubing Genesee 59-124
Heat transfer compound MG Chemicals 860-60G
Heatsink Digi-Key Electronics ATS2193-ND Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator AmScope LED-6W
Inactive Dry Yeast Genesee 62-108 Fly food ingredient
Incubator Pervical DR-41VL Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate Thermo Scientific 126965000 Fly food ingrediete
Micro cover glass VWR  48382-126 22 x 40 mm
Microscope slides Fisher Scientific  12-544-2 25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish Kleancolor
Narrow Drosophila vials Genesee 32-113RL
Objective  Zeiss 420852-9871-000 LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module TE Technology TE-127-1.0-0.8 30 x 30 mm
Plugs Genesee 49-102
Power Supply Circuit Specialists CSI1802X 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture Princeton Artist Brush Co. Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate Thermo Scientific 033241-36 Fly food ingredient
Stage insert  Wienecke and Sinske 432339-9030-000
Stereo Microscope Olympus SZ61 Any stereo microscope works
T-Fitting Genesee 59-123
Thermocouple data acquisition device Measurement Computing USB-2001-TC Single channel
Thermocouple microprobe Physitemp IT-24P 
Yellow Cornmeal Genesee 62-101 Fly food ingredient
Z-axis piezo stage Wienecke and Sinske 432339-9000-000

References

  1. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  2. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
  3. Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
  4. Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
  5. Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
  6. Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
  7. Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
  8. Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
  9. Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
  10. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
  11. Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
  12. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
  13. Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
  14. Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
  15. Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
  16. Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
  17. Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
  18. Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
  19. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
  20. Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
  21. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  22. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  23. Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
  24. Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
  25. Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
  26. Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
  27. Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
  28. Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
  29. Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).

Play Video

Citer Cet Article
Omelchenko, A. A., Bai, H., Hussain, S., Tyrrell, J. J., Klein, M., Ni, L. TACI: An ImageJ Plugin for 3D Calcium Imaging Analysis. J. Vis. Exp. (190), e64953, doi:10.3791/64953 (2022).

View Video