TACI : un plugin ImageJ pour l’analyse d’imagerie calcique 3D
Summary
TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) est un plugin ImageJ open-source pour l’analyse 3D de l’imagerie calcique qui examine le mouvement sur l’axe z et identifie la valeur maximale de chaque pile z pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Il peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais sur des plans z différents.
Abstract
La recherche en neurosciences a évolué pour utiliser des outils complexes d’imagerie et de calcul pour extraire des informations complètes à partir d’ensembles de données. L’imagerie calcique est une technique largement utilisée qui nécessite un logiciel sophistiqué pour obtenir des résultats fiables, mais de nombreux laboratoires ont du mal à adopter des méthodes de calcul lors de la mise à jour des protocoles pour répondre aux normes modernes. Des difficultés surviennent en raison d’un manque de connaissances en programmation et de paywalls pour les logiciels. De plus, les cellules d’intérêt affichent des mouvements dans toutes les directions pendant l’imagerie calcique. De nombreuses approches ont été développées pour corriger le mouvement dans la direction latérale (x/y).
Ce document décrit un flux de travail utilisant un nouveau plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), pour examiner le mouvement sur l’axe z en imagerie calcique 3D. Ce logiciel identifie la valeur de fluorescence maximale de toutes les positions z dans lesquelles un neurone apparaît et l’utilise pour représenter l’intensité du neurone à la position t correspondante. Par conséquent, cet outil peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais apparaissent sur des plans z distincts. En tant que plugin ImageJ, TACI est un outil de calcul convivial et open-source pour l’analyse d’imagerie calcique 3D. Nous avons validé ce flux de travail en utilisant des neurones thermosensibles aux larves de mouches qui affichaient des mouvements dans toutes les directions pendant la fluctuation de température et un ensemble de données d’imagerie calcique 3D acquises à partir du cerveau de la mouche.
Introduction
Le taux de calcium intracellulaire est un marqueur précis de l’excitabilité neuronale. L’imagerie calcique mesure les changements dans le calcium intracellulaire pour comprendre l’activité neuronale1. Les études en neurosciences ont de plus en plus utilisé cette méthode en raison du développement de techniques de mesure de la concentration intracellulaire de calcium, y compris des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP2,3, qui peuvent être exprimés de manière non invasive dans des ensembles spécifiques de neurones par des approches génétiques. La baisse des coûts des lasers et des composants de microscope a également augmenté l’utilisation de l’imagerie calcique4. Il est important de noter que l’imagerie calcique permet d’enregistrer et d’étudier simultanément des neurones uniques ainsi que de grandes populations de neurones chez des animaux en mouvement libre5.
Néanmoins, l’analyse des données d’imagerie calcique est difficile car (1) elle implique de suivre les changements de fluorescence des cellules individuelles au fil du temps, (2) le signal de fluorescence disparaît ou réapparaît par intermittence avec les réponses neuronales, et (3) les neurones peuvent se déplacer dans toutes les directions, en particulier dans et hors d’un plan focal ou apparaissant sur plusieurs plans4, 6. L’analyse manuelle prend beaucoup de temps et devient impraticable à mesure que la longueur des enregistrements et le nombre de neurones augmentent. Divers logiciels ont été développés pour accélérer le processus d’analyse de l’imagerie calcique. Auparavant, le logiciel était conçu dans un contexte expérimental limité, ce qui rendait difficile son adoption par d’autres laboratoires. Les efforts récents pour répondre aux normes modernes de partage de logiciels ont conduit au développement de plusieurs outils capables d’analyser de manière cohérente les données d’imagerie calcique dans différents groupes 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Cependant, la plupart de ces outils nécessitent des connaissances en programmation et / ou dépendent de logiciels commerciaux. Un manque de connaissances en programmation et de logiciels payants dissuade les chercheurs d’adopter ces méthodes. De plus, beaucoup de ces outils se concentrent sur la correction du mouvement x/y, bien que le mouvement sur l’axe z doive également être explicitement diagnostiqué et corrigé6. Il existe un besoin d’un outil informatique pour analyser l’imagerie calcique 3D qui se concentre sur les neurones présentant une dérive z et apparaissant sur plusieurs plans z. Idéalement, cet outil devrait utiliser un logiciel open source et ne pas nécessiter de connaissances en programmation pour permettre à d’autres laboratoires de l’adopter facilement.
Ici, nous avons développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, pour analyser les données d’imagerie calcique 3D. Tout d’abord, le logiciel renomme, si nécessaire, et organise les données d’imagerie calcique 3D par positions z. Les cellules d’intérêt sont suivies dans chaque position z, et leurs intensités de fluorescence sont extraites par TrackMate ou d’autres outils de calcul. TACI est ensuite appliqué pour examiner le mouvement sur l’axe z. Il identifie la valeur maximale d’une pile z et l’utilise pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Ce flux de travail est adapté à l’analyse de l’imagerie calcique 3D avec un mouvement dans toutes les directions et / ou avec des neurones se chevauchant dans la direction latérale (x / y) mais apparaissant dans différentes positions z. Pour valider ce flux de travail, des ensembles de données d’imagerie calcique 3D provenant de neurones thermosensibles aux larves de mouches et de neurones champignons dans le cerveau ont été utilisés. Il est à noter que TACI est un plugin ImageJ open-source et ne nécessite aucune connaissance en programmation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude a développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, et décrit un flux de travail analysant l’imagerie calcique 3D. De nombreux outils actuellement disponibles se concentrent sur la correction du mouvement x/y, bien que le mouvement sur l’axe z doive également être explicitement diagnostiqué ou corrigé6. Lors de l’acquisition d’images dans un organisme vivant, le mouvement sur l’axe z est inévitable même lorsque l’organisme est immobilisé, et certains stimuli, tels que le…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Un Zeiss LSM 880 dans le Fralin Imaging Center a été utilisé pour collecter les données d’imagerie calcique. Nous remercions le Dr Michelle L Olsen et Yuhang Pan pour leur aide avec le logiciel IMARIS. Nous remercions le Dr Lenwood S. Heath pour ses commentaires constructifs sur le manuscrit et Steven Giavasis pour ses commentaires sur le fichier GitHub README. Ce travail a été soutenu par NIH R21MH122987 (https://www.nimh.nih.gov/index.shtml) et NIH R01GM140130 (https://www.nigms.nih.gov/) à L.N. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
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