TACI：用于 3D 钙成像分析的 ImageJ 插件
Summary
TrackMate 钙成像分析 （TACI） 是一个用于 3D 钙成像分析的开源 ImageJ 插件，用于检查 z 轴上的运动并确定每个 z 堆栈的最大值，以表示细胞在相应时间点的强度。它可以分离在横向（x / y）方向上重叠但在不同的z平面上的神经元。
Abstract
神经科学研究已经发展到使用复杂的成像和计算工具从数据集中提取全面的信息。钙成像是一种广泛使用的技术，需要复杂的软件才能获得可靠的结果，但许多实验室在更新协议以满足现代标准时难以采用计算方法。由于缺乏编程知识和软件付费墙，出现了困难。此外，感兴趣的细胞在钙成像过程中显示所有方向的运动。已经开发出许多方法来校正横向（x/y）方向的运动。
本文描述了使用新的 ImageJ 插件 TrackMate 钙成像分析 （TACI） 来检查 3D 钙成像中 z 轴运动的工作流程。该软件从神经元出现的所有z位置识别最大荧光值，并使用它来表示神经元在相应t位置的强度。因此，此工具可以分离在横向 （x/y） 方向上重叠但出现在不同 z 平面上的神经元。作为 ImageJ 插件，TACI 是一种用户友好的开源计算工具，用于 3D 钙成像分析。我们使用苍蝇幼虫热敏神经元验证了这一工作流程，该神经元在温度波动期间显示所有方向的运动，并从苍蝇大脑获得的 3D 钙成像数据集。
Introduction
细胞内钙的水平是神经元兴奋性的精确标志物。钙成像测量细胞内钙的变化以了解神经元活动1。由于测量细胞内钙浓度的技术的发展，神经科学研究越来越多地使用这种方法，包括遗传编码钙指示剂（GECIs），例如GCaMP2，3，它可以通过遗传方法在特定神经元集中无创表达。激光器和显微镜组件成本的降低也增加了钙成像的使用4。重要的是，钙成像允许在自由移动的动物中同时记录和研究单个神经元以及大型神经元群5。
然而，钙成像数据的分析具有挑战性，因为（1）它涉及跟踪单个细胞的荧光随时间的变化，（2）荧光信号间歇性地消失或随着神经元反应而重新出现，以及（3）神经元可以向各个方向移动，特别是进出焦平面或出现在多个平面上4，6.手动分析非常耗时，并且随着记录长度和神经元数量的增加而变得不切实际。已经开发了各种软件程序来加速分析钙成像的过程。以前，软件是在有限的实验环境中设计的，这使得其他实验室难以采用它。最近为满足软件共享的现代标准所做的努力导致了几种工具的开发，这些工具可以一致地分析不同组的钙成像数据7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19.但是，这些工具中的大多数都需要编程知识和/或依赖于商业软件。缺乏编程知识和软件付费墙阻碍了研究人员采用这些方法。此外，其中许多工具专注于校正 x/y 运动，尽管 z 轴上的运动也需要明确诊断和校正6。需要一种计算工具来分析3D钙成像，该成像侧重于表现出z漂移并出现在多个z平面上的神经元。理想情况下，该工具应使用开源软件，并且不需要编程知识即可让其他实验室轻松采用它。
在这里，我们开发了一个新的ImageJ插件TACI，用于分析3D钙成像数据。首先，如果需要，软件会重命名，并按z位置组织3D钙成像数据。在每个z位置跟踪感兴趣的细胞，并通过TrackMate或其他计算工具提取其荧光强度。然后应用 TACI 来检查 z 轴上的运动。它标识 z 堆栈的最大值，并使用它来表示相应时间点的单元格强度。该工作流程适用于分析在所有方向上运动和/或神经元在横向（x/y）方向重叠但出现在不同z位置的3D钙成像。为了验证该工作流程，使用了来自大脑中苍蝇幼虫热敏神经元和蘑菇神经元的 3D 钙成像数据集。值得注意的是，TACI是一个开源的ImageJ插件，不需要任何编程知识。
Protocol
Representative Results
Discussion
这项研究开发了一个新的ImageJ插件TACI，并描述了分析3D钙成像的工作流程。许多当前可用的工具专注于校正 x/y 运动，尽管 z 轴上的运动也需要明确诊断或校正6。在活体生物体的图像采集过程中，即使生物体被固定，z轴上的运动也是不可避免的，并且某些刺激（例如温度变化）通常会导致显着的z漂移。增加z堆栈的高度将允许在整个成像过程中记录感兴趣的细胞;但是，分析 z 轴…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
弗拉林成像中心的蔡司LSM 880用于收集钙成像数据。我们感谢Michelle L Olsen博士和Yuhang Pan在IMARIS软件方面的帮助。我们感谢 Lenwood S. Heath 博士对手稿的建设性评论，感谢 Steven Giavasis 对 GitHub README 文件的评论。这项工作得到了NIH R21MH122987（https://www.nimh.nih.gov/index.shtml）和NIH R01GM140130（https://www.nigms.nih.gov/）对L.N.的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、发表决定或手稿准备方面没有任何作用。
Materials
| Blunt Fill Needel | BD | 303129 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientific | 10035-04-8 | Fly food ingredient |
| Carbon dioxide | Airgas | UN1013 | Size 200 High Pressure Steel Cylinder |
| CO2 bubbler kit | Genesee | 59-180 | |
| Confocal microscope LSM880 | Zeiss | 4109002107876000 | An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2. |
| DAQami software | Measurement Computing | ||
| Dextrose | Genesee | 62-113 | Fly food ingredient |
| Drosophila Agar | Genesee | 66-111 | Fly food ingredient |
| Ethanol | Decon Labs, Inc. | 64-17-5 | Fly food ingredient |
| Fly line: Ir21a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir21a-Gal80 | Dr. Lina Ni lab | ||
| Fly line: Ir68a-Gal4 | Dr. Aravinthan DT Samuel lab | A kind gift | |
| Fly line: Ir93a-Gal4 | Dr. Paul Garrity lab | A kind gift | |
| Fly line: UAS-GCaMP6 | Bloomington Drosophila Stock Center | 42750 | |
| Flypad | Genesee | 59-114 | |
| General purpose forged brass regulator | Gentec | G152 | |
| Gibco PBS pH 7.4 (1x) | Thermo Fisher Scientific | 10010-031 | |
| Green Drosophila tubing | Genesee | 59-124 | |
| Heat transfer compound | MG Chemicals | 860-60G | |
| Heatsink | Digi-Key Electronics | ATS2193-ND | Resize to 12.9 x 5.5 cm |
| Illuminator | AmScope | LED-6W | |
| Inactive Dry Yeast | Genesee | 62-108 | Fly food ingredient |
| Incubator | Pervical | DR-41VL | Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH. |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Thermo Scientific | 126965000 | Fly food ingrediete |
| Micro cover glass | VWR | 48382-126 | 22 x 40 mm |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-2 | 25 x 75 x 1.0 mm |
| Nail polish | Kleancolor | ||
| Narrow Drosophila vials | Genesee | 32-113RL | |
| Objective | Zeiss | 420852-9871-000 | LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27 |
| Peltier cooling module | TE Technology | TE-127-1.0-0.8 | 30 x 30 mm |
| Plugs | Genesee | 49-102 | |
| Power Supply | Circuit Specialists | CSI1802X | 10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply |
| Princeton Artist Brush Nepture | Princeton Artist Brush Co. | Series 4750, size 2 | |
| Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate | Thermo Scientific | 033241-36 | Fly food ingredient |
| Stage insert | Wienecke and Sinske | 432339-9030-000 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ61 | Any stereo microscope works |
| T-Fitting | Genesee | 59-123 | |
| Thermocouple data acquisition device | Measurement Computing | USB-2001-TC | Single channel |
| Thermocouple microprobe | Physitemp | IT-24P | |
| Yellow Cornmeal | Genesee | 62-101 | Fly food ingredient |
| Z-axis piezo stage | Wienecke and Sinske | 432339-9000-000 |
References
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).
- Zhang, Y., et al. jGCaMP8 fast genetically encoded calcium indicators. Janelia Research Campus. , (2020).
- Robbins, M., Christensen, C. N., Kaminski, C. F., Zlatic, M. Calcium imaging analysis – How far have we come. F1000Research. 10, 258 (2021).
- Oh, J., Lee, C., Kaang, B. K. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors. The Korean Journal of Physiology & Pharmacology. 23 (4), 237-249 (2019).
- Stringer, C., Pachitariu, M. Computational processing of neural recordings from calcium imaging data. Current Opinion in Neurobiology. 55, 22-31 (2019).
- Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. NoRMCorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data. Journal of Neuroscience Methods. 291, 83-94 (2017).
- Nguyen, J. P., Linder, A. N., Plummer, G. S., Shaevitz, J. W., Leifer, A. M. Automatically tracking neurons in a moving and deforming brain. PLoS Computational Biology. 13 (5), 1005517 (2017).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. EMC2: A versatile algorithm for robust tracking of calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. bioRxiv. , (2021).
- Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, 38173 (2019).
- Delestro, F., et al. In vivo large-scale analysis of Drosophila neuronal calcium traces by automated tracking of single somata. Scientific Reports. 10, 7153 (2020).
- Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25 (2020).
- Eglen, S. J., et al. Toward standard practices for sharing computer code and programs in neuroscience. Nature Neuroscience. 20 (6), 770-773 (2017).
- Pachitariu, M., et al. Suite2p: Beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. bioRxiv. , (2017).
- Corder, G., et al. An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain. Science. 363 (6424), 276-281 (2019).
- Lagache, T., Hanson, A., Pérez-Ortega, J. E., Fairhall, A., Yuste, R. Tracking calcium dynamics from individual neurons in behaving animals. PLoS Computational Biology. 17 (10), 1009432 (2021).
- Kolar, K., Dondorp, D., Zwiggelaar, J. C., Høyer, J., Chatzigeorgiou, M. Mesmerize is a dynamically adaptable user-friendly analysis platform for 2D and 3D calcium imaging data. Nature Communications. 12, 6569 (2021).
- Moein, M., et al. CaSiAn: A Calcium Signaling Analyzer tool. Bioinformatics. 34 (17), 3052-3054 (2018).
- Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, 28728 (2018).
- Neugornet, A., O’Donovan, B., Ortinski, P. I. Comparative effects of event detection methods on the analysis and interpretation of Ca(2+) imaging data. Frontiers in Neuroscience. 15, 620869 (2021).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Fazeli, E., et al. Automated cell tracking using StarDist and TrackMate. F1000Research. 9, 1279 (2020).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Ni, L., et al. The ionotropic receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila. Elife. 5, 13254 (2016).
- Omelchenko, A. A., et al. Cool and warm ionotropic receptors control multiple thermotaxes in Drosophila larvae. Frontiers in Molecular Neuroscience. , (2022).
- Sanchez-Alcaniz, J. A., et al. An expression atlas of variant ionotropic glutamate receptors identifies a molecular basis of carbonation sensing. Nature Communications. 9 (1), 4252 (2018).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Synchronous and opponent thermosensors use flexible cross-inhibition to orchestrate thermal homeostasis. Science Advances. 7 (35), (2021).
- Klein, M., et al. Sensory determinants of behavioral dynamics in Drosophila thermotaxis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (2), 220-229 (2015).
