Otimizando o processo de preparação de amostras para microscopia eletrônica de transmissão de junções neuromusculares em larvas de Drosophila
Summary
Este relatório fornece um novo procedimento de preparação de amostras para visualizar junções neuromusculares em larvas de Drosophila . Este método é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional e é particularmente útil para a análise ultraestrutural da junção neuromuscular de Drosophila .
Abstract
A junção neuromuscular de Drosophila (NMJ) emergiu como um sistema modelo valioso no campo da neurociência. A aplicação da microscopia confocal no Drosophila NMJ permite que os pesquisadores adquiram informações sinápticas, abrangendo dados quantitativos sobre a abundância de sinapses e insights detalhados sobre sua morfologia. No entanto, a distribuição difusa e o alcance visual limitado do MET apresentam desafios para a análise ultraestrutural. Este estudo apresenta um método inovador e eficiente de preparação de amostras que supera a abordagem convencional. O procedimento começa com a colocação de uma malha de metal na base de uma garrafa de fundo plano ou tubo de ensaio, seguido pelo posicionamento de amostras de larvas fixas na malha. Uma malha adicional é colocada sobre as amostras, garantindo que elas sejam posicionadas entre as duas malhas. As amostras fixas são completamente desidratadas e infiltradas antes de prosseguir com o procedimento de incorporação. Em seguida, a inclusão das amostras em resina epóxi é realizada de forma plana, o que permite a preparação dos músculos para posicionamento e secção. Beneficiando-se dessas etapas, todos os músculos das larvas de Drosophila podem ser visualizados sob microscopia de luz, facilitando o posicionamento e seccionamento subsequentes. O excesso de resina é removido após a localização dos6º e7º músculos dos segmentos corporais A2 e A3. É realizada seccionamento ultrafino em série do6º ou7º músculo.
Introduction
A microscopia eletrônica é um dos métodos mais ideais para estudar a ultraestrutura de materiais biológicos que podem demonstrar visualmente e com precisão a estrutura interna das células no nível1 em nanoescala. No entanto, devido à complexidade do processo de preparação da amostra e ao alto custo, a microscopia eletrônica não é tão popular quanto a microscopia de luz. Avanços recentes nas técnicas de microscopia eletrônica levaram a melhorias significativas na qualidade da imagem, coincidindo com uma redução notável na carga de trabalho associada. Consequentemente, a microscopia eletrônica tem assumido um papel importante no avanço do conhecimento científico em diversos campos2.
Drosophila é um excelente modelo animal para realizar manipulações genéticas para controlar com precisão a expressão espacial e temporal de genes-alvo3. Além disso, a Drosophila tem as vantagens de um curto período de crescimento e fácil criação em comparação com os modelos de mamíferos; portanto, Drosophila é amplamente utilizada em pesquisas morfológicas 4,5.
Nas larvas de Drosophila, os botões da junção neuromuscular (NMJ) são amplamente distribuídos nos músculos 6,7, e a imunomarcação da NMJ pode facilmente fornecer informações sobre a quantidade e morfologia das sinapses 8,9. Os botões NMJ localizados nos músculos6º/7º dos segmentos A2 e A3 são adequados para pesquisas quantitativas e morfológicas usando microscopia de luz. Isso se deve ao seu tamanho e abundância10,11. Portanto, as larvas de Drosophila NMJs são consideradas um modelo útil para pesquisas em neurociência12.
No entanto, é desafiador observar a ultraestrutura do botão da JNM pelo MET. Como a janela de varredura da microscopia eletrônica de transmissão é estreita, é difícil posicionar os botões NMJ amplamente distribuídos13. A outra razão é que a parede corporal da Drosophila é suscetível à ondulação durante a etapa de desidratação alcoólica do protocolo de preparação da amostra7.
Estudos tradicionais geralmente escolhem botões entre os músculos 6e 7 dos segmentos A2 e A3 como materiais de amostra devido à sua abundância e tamanho 14,15. Os6º e7º músculos dos segmentos A2 e A3 são maiores que os outros músculos e contêm mais boutons. No entanto, quando as amostras foram preparadas para microscopia eletrônica, as amostras fixas tenderam a se tornar finas e propensas a ondulação, levando ao posicionamento inadequado dos6º e7º músculos dos segmentos A2 e A3.
Relatamos um novo procedimento de processamento que é mais eficaz na prevenção do enrolamento das amostras em comparação com o método tradicional de preparo de amostras 7,16, permitindo que as amostras permaneçam planas durante a desidratação subsequente, facilitando assim um melhor posicionamento das junções neuromusculares larvais de Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
As amostras de larvas de Drosophila tendem a se enrolar durante a desidratação, pois as amostras são finas, dificultando a localização precisa da junção neuromuscular, aumentando assim a dificuldade e a carga de trabalho para a preparação da amostra. A melhoria tradicional é encurtar a amostra7, mas as amostras ainda estavam enroladas em diferentes graus.
Em nosso método, existem duas etapas críticas: primeiro, as amostras permanecem planas durante …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Natural Science Foundation of China Grant 32070811 e pelo Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Agradecemos ao Laboratório de Microscopia Eletrônica e Centro de Análise Morfológica, Escola de Medicina, Universidade do Sudeste, Nanjing, China.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
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