Optimalisatie van het monstervoorbereidingsproces voor transmissie-elektronenmicroscopie van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven
Summary
Dit rapport biedt een nieuwe procedure voor de voorbereiding van monsters voor het visualiseren van neuromusculaire juncties in Drosophila-larven . Deze methode is effectiever in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode en is met name nuttig voor de ultrastructurele analyse van de neuromusculaire junctie van Drosophila .
Abstract
De Drosophila neuromusculaire junctie (NMJ) is naar voren gekomen als een waardevol modelsysteem op het gebied van neurowetenschappen. De toepassing van confocale microscopie in de Drosophila NMJ stelt onderzoekers in staat om synaptische informatie te verkrijgen, die zowel kwantitatieve gegevens over de overvloed aan synapsen als gedetailleerde inzichten in hun morfologie omvat. De diffuse verdeling en het beperkte visuele bereik van de TEM vormen echter een uitdaging voor de ultrastructurele analyse. Deze studie introduceert een innovatieve en efficiënte methode voor monstervoorbereiding die de conventionele aanpak overtreft. De procedure begint met het plaatsen van een metalen gaas op de bodem van een fles of reageerbuis met platte bodem, gevolgd door het plaatsen van vaste larvenmonsters op het gaas. Een extra gaas wordt over de monsters geplaatst en zorgt ervoor dat ze tussen de twee mazen worden geplaatst. De vaste monsters worden grondig gedehydrateerd en geïnfiltreerd voordat wordt overgegaan tot de inbeddingsprocedure. Vervolgens wordt het inbedden van de monsters in epoxyhars uitgevoerd op een vlakke plaat, waardoor de spieren kunnen worden voorbereid op positionering en secties. Door gebruik te maken van deze stappen kunnen alle spieren van Drosophila-larven worden gevisualiseerd met lichtmicroscopie, waardoor de daaropvolgende positionering en secties worden vergemakkelijkt. Overtollig hars wordt verwijderd na het lokaliseren van de6e en 7espieren van lichaamssegmenten A, 2 en A, 3. Seriële ultradunne secties van de 6eof 7espier worden uitgevoerd.
Introduction
Elektronenmicroscopie is een van de meest ideale methoden voor het bestuderen van de ultrastructuur van biologische materialen die de interne structuur van cellen op nanoschaalniveau1 visueel en nauwkeurig kunnen aantonen. Vanwege de complexiteit van het monstervoorbereidingsproces en de hoge kosten is elektronenmicroscopie echter niet zo populair als lichtmicroscopie. Recente ontwikkelingen in elektronenmicroscopietechnieken hebben geleid tot aanzienlijke verbeteringen in de beeldkwaliteit, wat samenvalt met een opmerkelijke vermindering van de bijbehorende werklast. Elektronenmicroscopie heeft dan ook een belangrijke rol gespeeld bij het bevorderen van wetenschappelijke kennis op diverse gebieden2.
Drosophila is een uitstekend diermodel voor het uitvoeren van genetische manipulaties om de ruimtelijke en temporele expressie van doelgenen nauwkeurig te regelen3. Bovendien heeft Drosophila de voordelen van een korte groeiperiode en gemakkelijke opfok in vergelijking met zoogdiermodellen; daarom wordt Drosophila veel gebruikt in morfologieonderzoek 4,5.
Bij Drosophila-larven zijn neuromusculaire junctie (NMJ) boutons wijd verspreid in de spieren 6,7, en immunokleuring van NMJ kan gemakkelijk informatie geven over de hoeveelheid synaps en morfologie 8,9 . De NMJ-boutons die zich in de 6e/7espieren van deA2- en A3-segmenten bevinden, zijn zeer geschikt voor kwantitatief en morfologisch onderzoek met behulp van lichtmicroscopie. Dit komt door hun grootte en overvloed10,11. Daarom worden Drosophila-larven NMJ’s beschouwd als een nuttig model voor neurowetenschappelijk onderzoek12.
Het is echter een uitdaging om de NMJ bouton-ultrastructuur door de TEM waar te nemen. Omdat het scanvenster van transmissie-elektronenmicroscopie smal is, is het moeilijk om de wijdverspreide NMJ-boutons13 te positioneren. De andere reden is dat de lichaamswand van Drosophila gevoelig is voor krullen tijdens de alcoholuitdrogingsstap van het monstervoorbereidingsprotocol7.
Traditionele studies hebben meestal boutons tussen de 6een 7espieren van de A, 2 en A3 segmenten gekozen als monstermateriaal vanwege hun overvloed en grootte14,15. De 6een 7espieren van deA2– enA3-segmenten zijn groter dan de andere spieren en bevatten meer boutons. Wanneer monsters echter werden voorbereid voor elektronenmicroscopie, hadden vaste monsters de neiging dun te worden en vatbaar voor krullen, wat leidde tot een onjuiste positionering van de 6een 7espieren van de A2 en A3 segmenten.
Hierbij rapporteren we een nieuwe verwerkingsprocedure die effectiever is in het voorkomen van het krullen van de monsters in vergelijking met de traditionele methode van monstervoorbereiding 7,16, door de monsters plat te laten blijven tijdens de daaropvolgende uitdroging, waardoor een betere positionering van de neuromusculaire knooppunten van de Drosophila-larven wordt vergemakkelijkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Monsters van Drosophila-larven hebben de neiging om op te krullen tijdens uitdroging, omdat de monsters dun zijn, waardoor het moeilijk is om de neuromusculaire overgang nauwkeurig te lokaliseren, waardoor de moeilijkheidsgraad en werklast voor de monstervoorbereiding toenemen. De traditionele verbetering is om de steekproef7 in te korten, maar de steekproeven waren nog steeds in verschillende mate gekruld.
In onze methode zijn er twee cruciale stappen: ten eer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Natural Science Foundation of China Grant 32070811 en het Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. We danken het Laboratorium voor Elektronenmicroscopie en het Centrum voor Morfologische Analyse, School of Medicine, Southeast University, Nanjing, China.
Materials
| 1,2-Epoxypropane | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Penetrating Agent |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | The wild-type control Drosophila strains used in this research were all W1118, and were reared according to standard culture methods |
| Flat-bottomed glass test tubes | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Flat-bottomed glass test tubes(bottle)with sponge plug(or bottle stopper) |
| K4M cross-linker | Agar Scientific | Cat# 1924B | The embedding resins are based on a highly cross-linked acrylate and methacrylate formula |
| K4M resin (monomer B) | Agar Scientific | Lot# 631557 | Resin Monomer |
| Polyvinyl film | Haimen Chenxing Experimental equipment Company | none | Transparent polyethylene film is the best , thickness of about 0.2mm |
| SPI Chem DDSA | SPI | SpI#02827-AF | Dodecenyl Succinic Anhydride |
| SPI-Chem DMP-30 Epoxy | SPI | 02823-DA | Accelerator |
| SPI-Chem NMA | SPI | SpI#02828-AF | Hardner for Epoxy |
| SPI-PON 812 Epoxy | SPI | SPI#0259-AB | Resin Monomer |
| Steel mesh | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Copper or stainless steel net |
| Transmission electron microscopy | Hitachi H-7650 | 11416692 | All grids (on which samples were gathered) were stained with lead citrate and observed under a transmission electron microscopy. |
| Ultrathin microtome | Leica UC7 ultrathin microtome | 595915 | All sectioning operations are carried out on a Leica UC7 ultrathin microtome using a diamond knife |
References
- Acevedo, N. C., Marangoni, A. G. Nanostructured fat crystal systems. Annual Review of Food Science and Technology. 6, 71-96 (2015).
- Schorb, M., Haberbosch, I., Hagen, W. J. H., Schwab, Y., Mastronarde, D. N. Software tools for automated transmission electron microscopy. Nature Methods. 16 (6), 471-477 (2019).
- Winans, N. J., et al. A genomic investigation of ecological differentiation between free-living and Drosophila-associated bacteria. Molecular Ecology. 26 (17), 4536-4550 (2017).
- Phelps, J. S., et al. Reconstruction of motor control circuits in adult Drosophila using automated transmission electron microscopy. Cell. 184 (3), 759-774 (2021).
- Cardona, A., et al. An integrated micro- and macroarchitectural analysis of the Drosophila brain by computer-assisted serial section electron microscopy. PLoS Biology. 8 (10), (2010).
- Belalcazar, H. M., Hendricks, E. L., Zamurrad, S., Liebl, F. L. W., Secombe, J. The histone demethylase KDM5 is required for synaptic structure and function at the Drosophila neuromuscular junction. Cell Reports. 34 (7), 108753 (2021).
- Banerjee, S., Venkatesan, A., Bhat, M. A. Neurexin, neuroligin and wishful thinking coordinate synaptic cytoarchitecture and growth at neuromuscular junctions. Molecular Cell and Neurosciences. 78, 9-24 (2017).
- Guangming, G., Junhua, G., Chenchen, Z., Yang, M., Wei, X. Neurexin and neuroligins maintain the balance of ghost and satellite boutons at the Drosophila neuromuscular junction. Frontiers in Neuroanatomy. 14, 19 (2020).
- Jia, X. X., Gorczyca, M., Budnik, V. Ultrastructure of neuromuscular junctions in Drosophila: comparison of wild type and mutants with increased excitability. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1025-1044 (1993).
- Ashley, J., et al. Retrovirus-like gag protein Arc1 binds RNA and traffics across synaptic boutons. Cell. 172 (1-2), 262-274 (2018).
- Eaton, B. A., Fetter, R. D., Davis, G. W. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 34 (5), 729-741 (2002).
- Featherstone, D. E., Rushton, E., Broadie, K. Developmental regulation of glutamate receptor field size by nonvesicular glutamate release. Nature Neurosciences. 5 (2), 141-146 (2002).
- Wagner, N., Laugks, U., Heckmann, M., Asan, E., Neuser, K. Aging Drosophila melanogaster display altered pre- and postsynaptic ultrastructure at adult neuromuscular junctions. Journal of Comparative Neurology. 523 (16), 2457-2475 (2015).
- Atwood, H. L., Govind, C. K., Wu, C. F. Differential ultrastructure of synaptic terminals on ventral longitudinal abdominal muscles in Drosophila larvae. Journal of Neurobiology. 24 (8), 1008-1024 (1993).
- McCabe, B. D., et al. The BMP homolog Gbb provides a retrograde signal that regulates synaptic growth at the Drosophila neuromuscular junction. Neuron. 39 (2), 241-254 (2003).
- Guangming, G., Mei, C., Chenchen, Z., Wei, X., Junhua, G. Improved analysis method of neuromuscular junction in Drosophila. larvae by transmission electron microscopy. Anatomical Science International. 97 (1), 147-154 (2022).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. Journal of Visualized Experiments. (24), e1107 (2009).
- Lovrić, J., et al. Multimodal imaging of chemically fixed cells in preparation for NanoSIMS. Analytical Chemistry. 88 (17), 8841-8848 (2016).
- Woods, P. S., Ledbetter, M. C. Cell organelles at uncoated cryofractured surfaces as viewed with the scanning electron microscope. Journal of Cell Sciences. 21 (1), 47-58 (1976).
- Jan, L. Y., Jan, Y. N. Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila melanogaster. Journal of Physiology. 262 (1), 189-214 (1976).
- Prokop, A. Organization of the efferent system and structure of neuromuscular junctions in Drosophila. International Review in Neurobiology. 75, 71-90 (2006).
- Lloyd, T. E., et al. The p150(Glued) CAP-Gly domain regulates initiation of retrograde transport at synaptic termini. Neuron. 74 (2), 344-360 (2012).
- Budnik, V., Zhong, Y., Wu, C. F. Morphological plasticity of motor axons in Drosophila mutants with altered excitability. Journal of Neuroscience. 10 (11), 3754-3768 (1990).
- Zhang, X., et al. Neuroligin 4 regulates synaptic growth via the bone morphogenetic protein (BMP) signaling pathway at the Drosophila neuromuscular junction. Journal of Biological Chemistry. 292 (44), 17991-18005 (2017).
- Wu, S., et al. A pre-synaptic function of shank protein in Drosophila. Journal of Neuroscience. 37 (48), 11592-11604 (2017).
- Gan, G., Lv, H., Xie, W. Morphological identification and development of neurite in Drosophila ventral nerve cord neuropil. PLoS One. 9 (8), 105497 (2014).
